基于三维生物打印水凝胶包埋的脑类器官体外构建新方法
Rosalba Monica Ferraro, Paola Serena Ginestra, Miriam Seiti, Mattia Bugatti, Gabriele Benini, Luana Ottelli, William Vermi, Pietro Luigi Poliani, Elisabetta Ceretti, Silvia Giliani | Gels 2025 | DOI: 10.3390/gels11040284
标签: #三维生物打印 #脑类器官 #水凝胶生物墨水 #神经发育模型 #自动化培养
一、做什么 🔬
研究背景：传统脑类器官培养高度依赖人工将神经胚状体（nEBs）包埋于动物源性基质胶（Matrigel®）中。该操作技术门槛高、批次差异大、成本昂贵且难以规模化，严重制约了类器官在神经疾病建模和药物高通量筛选中的转化应用。
核心问题：
- 能否利用化学定义型水凝胶替代传统基质胶，实现脑类器官的标准化构建？
- 3D生物打印技术能否消除人工包埋的操作依赖性，提升类器官形态与分化的一致性？
- 新型SA-CMC-Matrigel®复合生物墨水在长期培养中能否维持足够的力学支撑与物质交换能力？
研究模型：人多能干细胞（iPSC）衍生的皮层脑类器官（cORGs）。
技术路线：
- iPSC神经诱导：使用AggreWell™微孔板规模化制备均一nEBs（约6000细胞/个）。
- 生物墨水配制与表征：将Matrigel®按1:10稀释于含1.5%海藻酸钠（SA）和1%羧甲基纤维素钠（CMC）的溶液中，测试降解率、剪切变稀粘度、溶胀率及大分子扩散能力。
- 3D生物打印包埋：将nEBs与生物墨水混合，通过挤出式生物打印机直接打印至24孔板，CaCl₂交联固化。
- 类器官成熟与多维表征：动态悬浮培养40天，通过免疫组化、免疫荧光及qPCR对比传统基质胶组与打印组的神经标志物表达、区域分化及内部细胞架构。
二、发现什么 📊
核心发现1：传统基质胶包埋法构建脑类器官的标准化流程与形态演变
图1：iPSC经5天诱导形成直径约200 μm的nEBs，第7天人工包埋于Matrigel®，第20天表面出现神经玫瑰花结，第40天直径显著增大。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | iPSC解离为单细胞，AggreWell板培养5天生成nEBs，第7天用宽口枪头人工滴加Matrigel®包埋，动态悬浮培养40天，每日明场显微镜记录形态 |
| 发现什么 | 第7天nEBs直径约200 μm，边缘致密；第10天包埋体表面出芽形成神经玫瑰花结；第20天体积持续扩张，第40天形成深色致密团块 |
| 说明什么 | 传统流程依赖人工经验，包埋位置随机导致内部结构不均一，但能成功诱导类器官基础形态发育 |
核心发现2：传统包埋脑类器官的神经标志物表达与细胞架构特征
图2：免疫组化显示PAX6+/Ki67+神经干细胞呈管状排列，SYP+神经元分布于外围；qPCR显示GFAP表达较iPSC显著升高（p<0.02），OCT4显著下降（p<0.0001）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 第40天收集类器官进行H&E染色、PAX6/Ki67/SYP免疫组化，提取RNA进行OCT4/PAX6/SOX2/TUBB3/DCX/MAP2/GFAP的qPCR定量 |
| 发现什么 | H&E显示中央高细胞密度区与外围低密度基质区；PAX6+/Ki67+细胞围绕中央管腔呈放射状排列；GFAP相对表达量较iPSC显著上调（p<0.02），OCT4显著下调（p<0.0001），TUBB3/DCX/MAP2呈上升趋势但未达统计学显著 |
| 说明什么 | 人工包埋能诱导皮层样分层结构及星形胶质细胞分化，但高变异度导致部分皮层神经元标志物表达波动大，批次间一致性受限 |
核心发现3：SA-CMC-Matrigel®复合生物墨水的流变特性与降解动力学
图3：水凝胶在37℃培养液中前两周重量损失缓慢，第4周完全降解；剪切速率<5 s⁻¹时粘度为71±5 mPa·s，118 s⁻¹时降至40±0 mPa·s。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 配制1:10 Matrigel®+1.5% SA+1% CMC水凝胶，CaCl₂交联后置于37℃神经培养基中连续称重监测降解；使用流变仪测试不同剪切速率下的粘度变化 |
| 发现什么 | 前两周重量损失控制在较低水平，第3周起加速降解，第4周完全崩解；低剪切下粘度71±5 mPa·s，高剪切下呈现剪切变稀效应降至40±0 mPa·s |
| 说明什么 | 前期缓慢降解为神经诱导提供稳定力学支撑，后期降解模拟体内ECM重塑；剪切变稀特性保障挤出打印时的顺畅性与细胞存活率 |
核心发现4：生物墨水打印成型能力、溶胀动力学与大分子扩散效率
图4：打印形成50×200×200 mm网格结构稳定；24小时溶胀率超2倍；BSA荧光扩散测试显示180分钟荧光强度较初始提升10倍。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将生物墨水装入无菌墨盒，挤出式打印至24孔板形成网格；浸泡于培养基监测重量变化评估溶胀；加载荧光标记牛血清白蛋白（BSA），定时荧光显微镜成像定量扩散强度 |
| 发现什么 | 打印结构形态均一稳定；24小时内吸水溶胀，最终重量翻倍；BSA荧光强度随时间呈指数上升，180分钟时达初始值的10倍 |
| 说明什么 | 墨水具备优异的成型保真度与结构完整性；高溶胀率与快速大分子扩散能力确保生长因子、代谢物及诱导信号在类器官内部高效交换 |
核心发现5：3D生物打印水凝胶包埋脑类器官的构建流程与延迟成熟表型
图5：打印组nEBs在第10天保持200 μm球形，第20天开始出芽，第40天直径达2 mm，形态发育较传统组延迟约10天。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 第7天将nEBs与SA-CMC-Matrigel®墨水混合，3D打印至24孔板，CaCl₂交联后置于摇床动态悬浮培养40天，每日明场显微镜记录形态演变 |
| 发现什么 | 第10天nEBs维持200 μm球形且边缘清晰；第20天表面始现神经玫瑰花结；第40天直径增长至约2 mm，体积与传统组相当，但出芽时间推迟约10天 |
| 说明什么 | 生物打印实现自动化包埋，消除人工误差；水凝胶初始刚度与Matrigel®浓度降低导致机械张力减弱，延缓了神经上皮折叠与玫瑰花结形成速度 |
核心发现6：打印脑类器官的神经分化效率与基因表达谱验证
图6：免疫组化显示PAX6+/Ki67+细胞弥散分布，SYP+神经元网络致密；qPCR证实SOX2、TUBB3、DCX（p<0.02）及MAP2（p<0.001）表达较iPSC显著上调。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 第40天打印组类器官进行H&E及PAX6/Ki67/SYP免疫组化，提取总RNA进行多神经标志物qPCR，以亲代iPSC为基线进行统计学差异分析 |
| 发现什么 | PAX6+/Ki67+增殖细胞不再局限于外周，而是弥散分布于类器官内部；SYP+神经元形成致密网络；SOX2、TUBB3、DCX相对表达量较iPSC显著升高（p<0.02），MAP2显著升高（p<0.001） |
| 说明什么 | SA-CMC-Matrigel®水凝胶完全兼容神经干细胞增殖与皮层神经元分化；内部细胞分布更均匀，标志物表达统计学显著性优于传统组，证明打印法具备更高的批次可重复性 |
三、说明什么 💡
领域意义：脑类器官培养长期受困于基质胶的人工操作依赖性与批次异质性。该研究证实化学定义型水凝胶结合3D生物打印可完全替代人工包埋，将类器官构建从“手艺活”转化为标准化、自动化的工程流程。学界此前认为高浓度动物源性基质是维持类器官三维架构的必要条件，该工作打破了这一认知，证明低浓度基质胶辅以SA/CMC力学调控同样能支撑皮层样结构发育，为类器官规模化制备提供了可复制的新范式。
临床/转化价值：
- 建立高通量、低成本的神经疾病体外筛选平台，消除操作者技术差异带来的数据噪音，提升药物毒性与疗效评估的可靠性。
- 为神经发育障碍、神经退行性疾病及脑肿瘤提供高度一致的类器官模型，加速靶向化合物筛选与机制解析。
- 水凝胶配方可进一步定制（如添加特定ECM蛋白或生长因子），实现患者特异性类器官的精准医疗应用与个体化用药指导。
与我们产品的关联：该研究核心依赖3D挤出式生物打印与动态悬浮培养。我们的Cellink BIO X/BIO X6可直接用于此类水凝胶墨水的打印工艺开发与参数优化；3Brain HD-MEA可用于打印后类器官的长期电生理活性监测；Celvivo微流控灌注系统可替代摇床，提供更稳定的营养梯度与剪切力控制，进一步加速类器官成熟并解决打印组发育延迟问题。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 直接用于SA-CMC-Matrigel®生物墨水的挤出打印工艺开发，精准控制打印压力、温度与交联时间，实现nEBs的高通量自动化包埋与结构成型。 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐⭐ | 用于打印成熟后脑类器官的长期无创电生理记录，评估SYP+神经元网络的动作电位发放频率、同步性及突触可塑性变化。 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐⭐ | 替代传统摇床悬浮培养，提供动态微流控灌注环境，优化水凝胶内部营养/代谢物交换，解决打印组成熟延迟问题并提升类器官存活率。 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐ | 适用于打印后类器官的高内涵成像与多通道荧光定量分析，但需针对3D球体结构优化光学切片算法与图像重建流程。 |
参考文献
- Lancaster MA, Renner M, Martin CA, et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 2013;501(7467):373-379. DOI: 10.1038/nature12517
- Lancaster MA, Knoblich JA. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2014;9(10):2329-2340. DOI: 10.1038/nprot.2014.158
- Giandomenico SL, Sutcliffe M, Paşca SP, et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 2019;22(4):669-679. DOI: 10.1038/s41593-019-0350-2
转发语：脑类器官培养终于告别“手工包埋”时代！这篇Gels新文章用3D打印+定制水凝胶实现了类器官的自动化构建，批次一致性大幅提升，神经标志物表达更稳定。做神经模型和药物筛选的实验室可以直接参考这套标准化流程。
联系人：李东伟
📞 18045130660 🌐 https://www.biokingdom.top
📥 下载原文PDF：Gels 2025 Three-Dimensional-Bioprinted Embedded-Based Cerebral Organoids