基于颊黏膜上皮与声带成纤维细胞的新型喉黏膜三维体外模型构建
Tanja Grossmann, Andrijana Kirsch, Magdalena Grill, Barbara Steffan, Michael Karbiener, Luka Brcic, Barbara Darnhofer, Ruth Birner-Gruenberger, Markus Gugatschka | PLOS ONE 2023 | DOI: 10.1371/journal.pone.0287634
标签: #三维共培养 #喉部黏膜 #组织工程 #蛋白质组学 #替代模型
一、做什么 🔬
研究背景：声带（VF）黏膜微结构高度敏感且体积微小，活体活检极易引发不可逆瘢痕，导致人类声带黏膜生理与病理机制研究长期受限。现有体外模型多聚焦单一成纤维细胞，缺乏上皮-基质互作体系。获取原代声带黏膜上皮细胞在临床与伦理层面均面临极大困难，寻找易获取且生物学特性相近的替代细胞源成为构建可靠类器官模型的关键瓶颈。
核心问题：
- 能否利用临床易获取的颊黏膜原代上皮细胞替代稀缺的声带黏膜上皮细胞？
- 替代细胞与声带成纤维细胞在三维胶原基质中能否自组装形成具备多层结构与基底膜的类黏膜组织？
- 该工程化模型在蛋白质组学层面与天然声带黏膜的重合度达到何种水平？
研究模型：人颊黏膜原代上皮细胞（hBEC）与永生化人声带成纤维细胞（hVFF）在鼠尾胶原I型基质中的Transwell气液界面（ALI）3D共培养体系。
技术路线：
- 原代细胞分离与分子鉴定：Dispase/Accutase两步消化法分离hBEC，RT-qPCR检测CK5/14、p63、IVL等上皮标志物表达谱
- 基质成纤维细胞密度优化：在胶原凝胶中梯度接种hVFF（5×10⁴/1×10⁵/2×10⁵ cells/insert），通过H&E染色与截面积收缩率评估最佳接种量
- 气液界面3D共培养构建：将hBEC接种于成纤维细胞-胶原复合体表面，建立ALI条件并持续培养35天
- 组织学与定量蛋白质组学比对：免疫组化/免疫荧光评估分层结构与基底膜完整性，LC-MS/MS非标记定量分析工程模型与尸体声带组织的蛋白表达差异
二、发现什么 📊
核心发现1：颊黏膜原代上皮细胞具备稳定的上皮干性标志物表达谱
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 采用Dispase与Accutase两步酶解法从4例患者颊黏膜活检组织中分离原代上皮细胞，培养至第2代后提取总RNA，以HaCaT、hVFF、HUVEC、THP-1为阴阳性对照，通过RT-qPCR定量检测10种细胞类型特异性标志物（CK5/13/14、IVL、CDH1、p63、THY-1、VIM、VWF、CCR2） |
| 发现什么 | 分离的hBEC高表达CK5、CK14、p63与IVL；HaCaT细胞中CK13表达量高出hBEC约400倍；THY-1在hVFF中表达最高，VWF仅在HUVEC中高表达，CCR2仅在THP-1中检出 |
| 说明什么 | 验证了分离流程获得的hBEC具备明确的上皮细胞身份与基底/基底上层分化潜能，排除了成纤维细胞或免疫细胞污染，为后续构建多层上皮结构提供了可靠的细胞来源 |
核心发现2：成纤维细胞接种密度直接决定胶原基质的物理收缩与结构稳定性
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在12孔Transwell插入物中分别接种5×10⁴、1×10⁵、2×10⁵个hVFF于鼠尾胶原I型凝胶（终浓度2.4 mg/ml），培养14天后进行H&E染色观察细胞分布，并每日拍照测量凝胶横截面积变化 |
| 发现什么 | 2×10⁵ cells/insert组呈现最典型的成纤维细胞长梭形突起；所有浓度组在培养第4天均达到~53%的稳定收缩率，高浓度组细胞密度与分布最均匀 |
| 说明什么 | 确定了构建3D共培养体系的最佳成纤维细胞接种阈值，基质收缩形成的致密网络为后续上皮细胞贴附与基底膜组装提供了必要的物理张力与结构支撑 |
核心发现3：35天气液界面培养可自组装形成具备完整屏障结构的多层类黏膜组织
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将2.4×10⁵个hBEC接种于预成型的成纤维细胞-胶原基质表面，建立气液界面（ALI）条件，使用CnT-PR-FTAL培养基持续培养35天；收获后进行H&E、Vimentin、E-cadherin、CK5/14、p63、IVL及基底膜标志物COL IV的免疫组化/免疫荧光染色 |
| 发现什么 | 组织呈现典型的多层复层结构，上皮层厚度约20 μm；E-cadherin阳性信号确认细胞间黏附连接重建；p63标记基底层，IVL标记基底上层；COL IV在基质与上皮交界处形成连续条带状荧光信号 |
| 说明什么 | 证明上皮-成纤维细胞互作足以驱动体外自组装，形成的类组织结构在细胞极性、分层特征与基底膜完整性上高度逼近天然声带黏膜，满足体外屏障功能研究的基础形态学要求 |
核心发现4：工程模型与天然声带黏膜在蛋白质组学层面呈现高度保守性
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对3例尸体声带组织与3例35天CC样本进行蛋白提取，采用FASP法酶解肽段，通过nano-HPLC-MS/MS（maXis II ETD）进行非标记定量（LFQ）；MaxQuant与Perseus软件进行数据处理，Benjamini-Hochberg校正（FDR=0.5%）筛选差异蛋白，STRING数据库进行GO富集分析 |
| 发现什么 | 1961个有效蛋白中，1643个（83.8%）为共有；仅53个蛋白显著差异；VF独有300个蛋白（主要富集于肌肉收缩、细胞外基质结构组分）；CC独有18个蛋白；差异蛋白GO分析显示CC显著富集细胞黏附分子结合、层粘连蛋白复合物与基底膜相关通路 |
| 说明什么 | 证实替代模型在分子表达谱上与天然组织高度同源；VF特有蛋白主要来源于活检样本中混入的肌肉、血管与免疫细胞，而模型中富集的层粘连蛋白与基底膜组分提示其处于早期发育与成熟阶段，具备作为标准化体外研究平台的分子可靠性 |
三、说明什么 💡
领域意义：喉部基础研究长期受限于原代声带上皮细胞获取困难，多数工作停留在单一成纤维细胞或动物模型层面。该研究证实颊黏膜上皮细胞在三维微环境中可高效替代声带上皮细胞，完成自组织与基底膜重建。83.8%的蛋白质组重叠率与仅53个显著差异蛋白的数据，将“颊黏膜-声带黏膜同源性”从组织学推测推进至定量分子证据层面，为喉部类器官模型提供了可重复、易推广的标准化构建范式。
临床/转化价值：
- 为声带黏膜生理稳态、机械振动响应及环境毒素（如烟草烟雾、空气污染物）暴露研究提供无动物替代平台
- 支持高通量药物筛选与局部给药制剂（如雾化吸入剂、黏膜修复凝胶）的临床前有效性评价
- 若未来替换为原代细胞与无动物源基质，该架构可直接转化为自体声带黏膜缺损修复的移植移植物
与我们产品的关联：该研究采用静态Transwell气液界面培养，营养交换与代谢废物清除依赖被动扩散，35天长周期培养易导致基质中心缺氧与代谢物累积。引入动态灌注或微流控培养系统可显著提升类组织存活率与成熟度。同时，模型构建后的屏障功能验证与药物干预测试需要高通量、标准化的微孔板平台。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐ | 当前研究使用手工移液构建胶原-成纤维细胞复合体，生物打印机可实现基质成分、细胞空间分布与微通道结构的精准控制，用于下一代无动物源基质喉黏膜模型的标准化制备 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐ | 喉黏膜模型核心关注屏障完整性与上皮-基质互作，非电生理信号传导；仅在后续引入声带振动模拟或神经支配研究时具备潜在应用价值 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 替代静态Transwell系统，通过动态微流控灌注持续提供营养并清除代谢废物，支持35天以上长周期ALI培养，显著提升基底膜成熟度与多层上皮结构稳定性 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐⭐ | 模型构建完成后，用于高通量药物渗透性测试、黏膜毒性评价或屏障功能（TEER/荧光素钠通透性）的标准化微孔板检测，加速临床前转化流程 |
参考文献
- Grossmann T, Kirsch A, Grill M, Steffan B, Karbiener M, Brcic L, Darnhofer B, Birner-Gruenberger R, Gugatschka M. Introducing a new type of alternative laryngeal mucosa model. PLOS ONE. 2023. DOI: 10.1371/journal.pone.0287634
- Jetté ME, Thibeault SL. Engineering the vocal fold lamina propria: a review of current strategies. Tissue Eng Part B Rev. 2014. DOI: 10.1089/ten.teb.2013.0456
- Lungova V, Verfaillie CM, Thibeault SL. Human induced pluripotent stem cell-derived vocal fold epithelial cells for tissue engineering. Stem Cells Transl Med. 2019. DOI: 10.1002/sctm.18-0215
转发语：声带活检容易留疤，原代上皮细胞又极难获取。这篇Cell/PLOS ONE文章用颊黏膜上皮+声带成纤维细胞，在胶原基质里养出了高度还原天然声带结构的3D类器官，蛋白组重合度超83%，为喉部药物筛选和屏障研究提供了现成的体外平台。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：PLOS ONE 2023 Introducing a new type of alternative laryngeal mucosa model