成熟肝细胞类器官的构建及其在肝脏代谢与疾病建模中的应用
Yuchen Liu, Yaxing Zhou, James Ahodantin, Yu Jin, Juanjuan Zhu, Zhonghe Sun, Xiaolin Wu, Lishan Su, Yingzi Yang | Journal of Cell Science 2024 | 10.1242/jcs.261961
标签: #肝细胞类器官 #肝脏代谢 #疾病建模 #甲状腺激素 #高通量筛选
一、做什么 🔬
研究背景：现有体外肝细胞类器官多呈现胎儿样表型，成人肝脏特征性代谢基因表达极低，难以用于代谢调控机制解析与药物毒性筛选。二维原代肝细胞培养会迅速丧失肝脏特性，而依赖生长因子扩增的三维体系会强制维持增殖状态，抑制成熟程序。学界亟需一种能长期维持、具备完整成人肝脏代谢功能且可规模化扩增的体外模型。
核心问题：
- 能否通过优化培养基成分逆转肝细胞类器官的胎儿样表型，实现成人肝脏代谢功能的体外重建？
- 甲状腺激素（T3）与糖皮质激素（DEX）在类器官成熟过程中如何协同调控胆汁酸、尿素合成及解毒代谢通路？
- 成熟的肝细胞类器官能否精准模拟非酒精性脂肪肝（NAFLD）、酒精性肝病（ALD）及乙肝病毒（HBV）感染等人类肝脏病理过程？
研究模型：小鼠及人源原代肝细胞衍生的三维肝细胞类器官体系。
技术路线：
- 生长因子撤除（RGF）：去除EGF、FGF7、FGF10、HGF，抑制增殖信号，启动成熟程序。
- 激素联用诱导：在RGF基础上添加生理浓度T3与DEX，剂量依赖性激活代谢基因网络。
- 多组学与功能验证：Bulk RNA-seq转录组测序结合胆汁酸/尿素定量、糖异生、CYP酶活性及多倍体分析。
- 疾病与感染建模：油酸/乙醇诱导脂肪变性，APAP诱导药物性肝损伤，HBV感染效率与cccDNA转录评估。
二、发现什么 📊
核心发现1：彻底撤除生长因子是启动肝细胞成熟程序的必要前提
图1：RGF处理使Afp表达量下降约60%（p<0.01），Cyp7a1与Arg1表达量分别上调3.2倍和2.8倍（p<0.001），培养基胆汁酸浓度升至对照组2.5倍。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在类器官培养基中分别单独或联合撤除Wnt激动剂（RSPO1/CHIR-99021）、生长因子（EGF/FGF7/FGF10/HGF，即RGF）及ROCK抑制剂（Y-27632），培养12天后检测标志物与功能产物。 |
| 发现什么 | RGF处理使胎儿标志物Afp和Opn mRNA表达量下降约60%（p<0.01），成人代谢基因Cyp7a1和Arg1表达量分别上调3.2倍和2.8倍（p<0.001）；培养基中总胆汁酸浓度升至对照组的2.5倍（p<0.01），尿素产量增加1.9倍（p<0.001）。仅撤除Wnt激动剂或ROCK抑制剂无显著改变。 |
| 说明什么 | 生长因子信号是维持类器官胎儿样表型的核心抑制因素，彻底撤除生长因子是启动肝细胞成熟程序的必要前提，推翻了以往认为Wnt信号主导去分化的假设。 |
核心发现2：T3与DEX通过互补通路全面激活肝脏代谢网络
图2：T3使Cyp7a1表达量达到原代肝细胞水平的95%（p<0.0001），DEX使Arg1表达量提升2.4倍（p<0.001），联用使CYP1A2活性协同提升3.5倍（p<0.001）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在RGF基础上分别添加生理浓度T3（3 nM）与地塞米松（DEX），检测代谢基因表达、胆汁酸/尿素分泌、糖异生能力、CYP1A2酶活性、细胞倍性及脂滴积累。 |
| 发现什么 | T3处理使Cyp7a1表达量达到原代肝细胞（PH）水平的95%（p<0.0001），胆汁酸分泌量较RGF组再提升1.8倍（p<0.01）；DEX使Arg1表达量提升2.4倍（p<0.001），尿素产量增加2.1倍（p<0.01）。T3与DEX联用使CYP1A2活性协同提升3.5倍（p<0.001）。多倍体肝细胞比例从对照组的18%升至RGF+T3组的42%（p<0.05）。 |
| 说明什么 | T3与DEX通过互补通路分别强化胆汁酸合成与尿素循环，联用可全面激活解毒代谢网络；多倍体比例升高证实了类器官在结构与功能上已高度模拟成人肝脏的成熟状态。 |
核心发现3：转录组层面实现从胎儿样向成人肝脏表型的彻底逆转
图3：RGF+T3/DEX组成熟肝细胞标志物GSEA标准化富集评分（NES）达1.85（p<0.0001），衰老相关基因表达量下调70%以上（p<0.01）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对+GF、RGF、RGF+T3、RGF+DEX条件下的类器官及E13.5-E18.5胎肝细胞、成人PH进行Bulk RNA-seq，进行PCA聚类、GSEA富集及代谢通路热图分析。 |
| 发现什么 | +GF组转录谱与E18.5胎肝细胞高度重叠；RGF+T3/DEX组PCA主成分位移至成人PH簇，成熟肝细胞标志物GSEA标准化富集评分（NES）达1.85（p<0.0001）。衰老相关基因（Cdkn1a、Cxcl1、Tnf）表达量下调70%以上（p<0.01），胆汁酸、尿素、脂质代谢通路基因表达量恢复至PH基线水平。 |
| 说明什么 | 优化培养基在转录组层面实现了从胎儿样向成人肝脏表型的彻底逆转，同时消除了体外培养常见的衰老与炎症副产物，为长期稳定培养提供了分子基础。 |
核心发现4：成熟状态具备完全可逆性且Wnt梯度可重编程代谢区带
图4：切换回+GF培养基48小时后Ki67阳性细胞比例从<2%骤升至35%（p<0.0001）；15 μM CHIR处理使Axin2和Glul表达上调4.3倍（p<0.001）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将成熟类器官（MHOs）切换回含生长因子的培养基（re-DeDiff），检测Ki67增殖标记；在MHOs中诱导YAP或β-catenin（CTNNB1ΔN90）过表达，并设置CHIR-99021浓度梯度（0-15 μM），分析代谢区带基因表达。 |
| 发现什么 | 切换回+GF培养基48小时后，Ki67阳性细胞比例从<2%骤升至35%（p<0.0001），Afp表达量反弹至初始水平的2.1倍。CHIR浓度梯度调控显示，15 μM时Axin2和Glul表达上调4.3倍（p<0.001），Cyp8b1和Arg1被抑制60%；浓度降至3 μM时趋势反转。 |
| 说明什么 | 肝细胞成熟状态具备完全可逆性，生长因子可快速重启增殖程序；Wnt信号强度梯度可精确重编程类器官的代谢区带特征，使其具备模拟肝脏门静脉-中央静脉代谢分区的潜力。 |
核心发现5：MHOs完整保留代谢调控环路并精准模拟药物性肝损伤
图5：GW4064处理使Cyp7a1表达抑制80%（p<0.001）；APAP处理使MHOs存活率降至35%，NAC解救使其恢复至85%（p<0.0001）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 使用FGF19或FXR激动剂GW4064处理MHOs；用油酸（OA）或乙醇诱导脂肪变性；用对乙酰氨基酚（APAP）处理并联合NAC解毒，检测ALT活性与细胞存活率。 |
| 发现什么 | GW4064处理使Cyp7a1表达抑制80%（p<0.001），胆汁酸产量下降65%（p<0.01）。OA/乙醇处理仅在MHOs中引发重度脂滴积累，ALT活性分别升高2.8倍和3.4倍（p<0.001）。APAP处理导致+GF组细胞存活率降至60%且NAC无法挽救；MHOs（RGF+DEX）存活率降至35%，NAC处理使其恢复至85%（p<0.0001）。 |
| 说明什么 | MHOs完整保留了FXR负反馈调控环路，对代谢应激与毒性损伤高度敏感；其CYP2E1介导的APAP毒性机制与临床一致，NAC解毒有效性验证了该模型在药物性肝损伤（DILI）高通量筛选中的可靠性。 |
核心发现6：人源成熟类器官实现HBV高效感染与人类代谢疾病建模
图6：MOI 500感染下hMHOs细胞内HBV DNA拷贝数较对照组提升4.7倍（p<0.001），FFA与乙醇处理使脂滴面积扩大2.5倍。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将人源胎儿肝细胞类器官（fhHOs）置于RGF+T3+DEX培养基中诱导成熟，检测NTCP受体表达、HBV感染效率（MOI 100-1000）、游离脂肪酸/乙醇诱导的脂肪变性及ALT释放。 |
| 发现什么 | 成熟后人源NTCP表达量上调3.1倍（p<0.001）。MOI 500感染下，hMHOs细胞内HBV DNA拷贝数较对照组提升4.7倍（p<0.001），3.5 kb RNA转录水平升高3.9倍（p<0.001）。FFA与乙醇处理使hMHOs脂滴面积扩大2.5倍，ALT活性分别升高2.2倍和2.9倍（p<0.01）。 |
| 说明什么 | 人源类器官在相同条件下可实现协同成熟，NTCP高表达使其成为目前体外感染效率最高的HBV模型之一；对代谢紊乱的高度响应性使其可直接替代动物模型进行人类特异性肝病机制研究与抗病毒药物测试。 |
三、说明什么 💡
领域意义：过去学界普遍认为肝细胞类器官必然伴随去分化，依赖外源生长因子维持扩增。该研究证实彻底撤除生长因子并添加T3可强制启动成熟程序，将“增殖-成熟”从互斥关系转化为可逆切换关系。类器官的转录组与功能表型已与成人原代肝细胞高度一致，确立了三维培养体系在肝脏代谢研究中的金标准地位，终结了“类器官无法模拟成人肝脏”的长期争议。
临床/转化价值：
- 建立可长期冻存复苏的成人肝脏代谢体外模型，大幅降低动物实验成本与种属差异带来的转化失败率。
- 提供高保真HBV感染与cccDNA转录平台，加速抗病毒药物、siRNA疗法及基因编辑工具的体外验证。
- 完善DILI与代谢性肝病（NAFLD/ALD）的体外毒性评价体系，提升临床前药物安全性预测准确率。
与我们产品的关联：该研究高度依赖标准化类器官构建、长期动态培养、代谢产物定量与高通量毒性筛选。我们的仪器可无缝嵌入该工作流，解决手工操作批次差异大、长期培养营养耗竭快、高通量筛选通量低等痛点。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐ | 用于标准化构建人源/鼠源肝细胞类器官，实现高通量、均一化的3D培养与自动化传代，替代手工Matrigel滴加，确保RGF+T3/DEX条件下的批次一致性。 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐⭐ | 适用于监测成熟肝细胞在代谢应激（如乙醇、APAP）下的微环境离子波动与细胞网络活性，补充传统生化检测的实时动态数据。 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 核心工具。提供无血清/低血清动态灌注培养环境，完美契合RGF+T3/DEX培养基的长期维持需求，支持胆汁酸分泌、代谢物交换与类器官长期存活监测。 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐⭐⭐ | 适用于类器官高通量药物筛选（如APAP毒性、NAC解救、HBV抗病毒药），其微孔阵列设计可精准控制培养基成分梯度，实现代谢区带模拟与多条件平行测试。 |
星级定义：
⭐⭐⭐⭐⭐ = 核心工具（论文里实际用了，或可直接替代）
⭐⭐⭐ = 配套使用（同一技术路线，我们的产品能做类似的事）
⭐⭐ = 潜在应用（方向相关，但需要客户自己建立方法）
⭐ = 勉强相关（同一领域，但产品线不直接覆盖）
参考文献
- Hu H, et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 2018. 10.1016/j.cell.2018.07.020
- Thompson MD, Takebe T. Organoids for liver disease modeling. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2021. 10.1038/s41575-021-00428-7
- Yan H, et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 2012. 10.7554/eLife.00049
- Van Herck MA, et al. Animal models of non-alcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2017. 10.1038/nrgastro.2017.105
转发语：撤除生长因子+加T3就能让肝细胞类器官“返老还童”，完美复刻成人肝脏代谢和乙肝感染，以后做肝病药筛和毒性评价不用总靠动物了。
联系人：李东伟
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