人源iPSC视网膜类器官与小胶质样细胞共培养模型的构建与功能验证
Valeria Chichagova, Maria Georgiou, Madeleine Carter, Birthe Dorgau, Gerrit Hilgen, Joseph Collin, Rachel Queen, Git Chung, Jila Ajeian, Marina Moya-Molina, Stefan Kustermann, Francois Pognan, Philip Hewitt, Michael Schmitt, Evelyne Sernagor, Lyle Armstrong, Majlinda Lako | J Cell Mol Med 2023 | 10.1111/jcmm.17670
标签: #视网膜类器官 #小胶质细胞 #hiPSC共培养 #多电极阵列 #神经免疫互作
一、做什么 🔬
研究背景：现有hiPSC视网膜类器官因缺乏免疫细胞组分，无法模拟视网膜发育期的神经-免疫互作及炎症病理。小胶质细胞在突触修剪、血管发育及神经退行性疾病中发挥核心调控作用。传统类器官模型难以解析免疫微环境对视网膜层状结构与光信号转导的直接影响。
核心问题：
- 能否在体外定向分化出具备吞噬与炎症应答功能的人源iPSC小胶质样细胞（iMG）？
- 将iMG在发育第13周引入视网膜类器官后，能否成功迁移并定植于类器官内部？
- 引入免疫细胞是否干扰视网膜类器官的正常层状结构与光响应电生理功能？
- 共培养体系能否在脂多糖（LPS）刺激下重现生理性的促炎/抗炎细胞因子释放谱？
研究模型：hiPSC来源的视网膜类器官与hiPSC定向分化的小胶质样细胞（iMG）三维共培养体系。
技术路线：
- 定向分化：通过BMP4、M-CSF、GM-CSF等因子梯度诱导hiPSC向中胚层及髓系祖细胞分化，最终获得iMG。
- 时序共培养：在视网膜类器官分化第13周加入iMG，模拟胚胎期小胶质细胞迁入视网膜的时间窗。
- 单细胞转录组测序：利用scRNA-seq解析共培养体系内细胞簇的组成比例与基因表达特征。
- 多电极阵列记录：使用4096通道HD-MEA记录视网膜神经节细胞（RGC）在暗态与白光脉冲下的放电活动。
- 炎症刺激与因子检测：施加100 ng/ml LPS刺激24小时，采用V-PLEX 30-plex试剂盒定量分析细胞因子释放水平。
二、发现什么 📊
核心发现1：iMG分化效率与标志物表达随时间稳步提升
图1：流式细胞术显示CD14+与CX3CR1+细胞比例随分化时间延长持续上升，成熟阶段IBA1+细胞占比超过40%。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 采用BMP4诱导中胚层，序贯添加M-CSF、IL-3、TPO、SCF促髓系祖细胞生成，第14天起切换至含GM-CSF与IL-34的成熟培养基，每4天传代，流式检测CD14/CX3CR1双阳性比例，免疫荧光验证IBA1表达 |
| 发现什么 | CD14/CX3CR1双阳性细胞比例逐周递增，成熟期IBA1免疫荧光阳性率达100%，TREM2、TMEM119、MERTK等微胶质特征基因表达量较原代细胞系提升1.2-1.8倍 |
| 说明什么 | 体外定向分化方案可高效获得转录组与蛋白表型均接近原代视网膜小胶质细胞的iMG群体，为后续共培养提供标准化细胞源 |
核心发现2：iMG具备高效吞噬活性与内毒素应答能力
图2：添加荧光微球后约90%的iMG细胞发生吞噬，LPS刺激24小时后IL-6、TNF-α等促炎因子释放量较原代细胞提升1.5倍以上。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将1.0 μm荧光微球按200:1比例与iMG共孵育3小时，流式定量吞噬率；同时施加100 ng/ml LPS刺激24小时，检测上清30种细胞因子 |
| 发现什么 | 流式检测显示~90%的iMG成功内化微球并伴随形态由半激活态转为阿米巴样；LPS刺激后IL-6、TNF-α、IL-1β等28种因子显著上调，其中TNF-α释放浓度达原代HMC3细胞的1.6倍 |
| 说明什么 | iMG不仅保留完整的吞噬清除功能，且对病原体相关分子模式具备高度敏感的炎症级联放大能力，满足免疫细胞功能验证标准 |
核心发现3：iMG成功迁入类器官内部且不破坏视网膜基础结构
图3：共培养第15周可见iMG附着于类器官表面，第22周透射电镜清晰显示iMG已深入神经上皮层并保留脂质内含物特征。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在视网膜类器官分化第13周以5000 cells/100 μl密度加入iMG，持续培养至第22周，进行明场追踪、免疫荧光切片与透射电镜超微结构观察 |
| 发现什么 | 第15周iMG定位于类器官外周，第22周IBA1+细胞均匀分布于内核层与外核层交界处；TEM显示类器官连接纤毛、内节结构完整，iMG呈现典型巨噬细胞样脂质包涵体形态 |
| 说明什么 | iMG能够跨越类器官物理屏障完成三维空间定植，且未干扰视网膜祖细胞向光感受器与中间神经元的正常层状分化 |
核心发现4：共培养体系单细胞图谱显示视杆细胞比例特异性升高
图4：单细胞转录组聚类鉴定出21个细胞亚群，共培养组视杆细胞（Rods）占比由对照组的18.4%升至24.7%，Müller胶质细胞由12.1%降至8.3%。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对第22周对照组与iMG共培养组视网膜类器官进行10x Genomics scRNA-seq，Seurat流程质控后合并分析，Wilcoxon检验鉴定差异基因 |
| 发现什么 | 共获得~51,000个高质量细胞，聚类识别出光感受器、双极细胞、RGC、Müller胶质等21个簇；共培养组Rods簇频率显著增加（24.7% vs 18.4%），Müller胶质簇频率下降（8.3% vs 12.1%），未独立检出iMG簇 |
| 说明什么 | iMG的旁分泌信号可能通过微环境重塑促进视杆前体细胞存活或增殖，同时提示iMG在长期共培养中比例较低或易在单细胞解离步骤中丢失 |
核心发现5：视网膜类器官光响应电生理功能在共培养后保持完整
图5：4096通道MEA记录显示，共培养组ON型RGC放电频率增加10.5%，OFF型RGC放电频率降低11.8%，与对照组无统计学差异（p=0.34）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将第22周类器官纵向切开，RGC层朝下贴附于3Brain HD-MEA芯片，记录暗态自发活动后给予200 ms全视野白光脉冲，提取单细胞放电序列 |
| 发现什么 | 共培养组ON型RGC响应细胞比例略升（10.5% vs 7.5%，p=0.065），OFF型RGC响应比例无差异；两组平均放电频率变化幅度分别为10.5%与11.8%，Mann-Whitney检验p=0.34 |
| 说明什么 | iMG的引入未改变视网膜神经节细胞的光信号转导通路与突触传递效率，类器官核心视觉功能保持生理稳态 |
核心发现6：共培养体系在LPS攻击下重现生理性促炎/抗炎平衡
图6：LPS刺激24小时后，共培养组IL-10与IL-13释放量分别较单纯类器官组提升2.1倍与1.8倍，TNF-α与IL-1β同步上调。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对第15周共培养类器官施加100 ng/ml LPS处理24小时，收集条件培养基，采用V-PLEX 30-plex电化学发光平台定量检测细胞因子 |
| 发现什么 | 共培养组IL-1α、IL-12/23p40、IL-15、IL-16、TNF-β、IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α、IL-13共10种因子显著升高；其中抗炎因子IL-10浓度达单纯类器官组的2.1倍，IL-13达1.8倍，整体释放水平低于iMG单培养组 |
| 说明什么 | 类器官内低比例iMG即可介导完整的炎症应答，且系统自发上调IL-10/IL-13以拮抗过度炎症，高度模拟体内视网膜免疫微环境的负反馈调节机制 |
三、说明什么 💡
领域意义：传统视网膜类器官因缺失免疫组分，难以模拟神经退行性疾病中的胶质-神经元互作。本研究首次证实iMG可在特定发育窗口期成功整合入hiPSC视网膜类器官，并保留吞噬、炎症应答与旁分泌调控功能。该模型将“纯神经元/胶质”范式推进至“神经-免疫复合”范式，为解析小胶质细胞在视网膜发育修剪与炎症风暴中的双重角色提供了标准化体外平台。
临床/转化价值：
- 基因治疗安全性评估：AAV载体递送常引发眼内炎症，该模型可直接量化载体对视网膜微胶质细胞的激活阈值。
- 神经退行性疾病机制解析：AMD、糖尿病视网膜病变中微胶质异常活化是关键病理环节，模型支持靶向TREM2或补体通路的药物筛选。
- 免疫调节剂开发：IL-10/IL-13的自发上调提示该体系可用于测试抗炎小分子或生物制剂的神经保护效力。
与我们产品的关联：论文实际使用了3Brain的4096通道MEA记录光响应。若需优化iMG长期存活与三维空间分布，微流控芯片与动态灌注系统是关键。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐ | 用于构建含血管化或免疫细胞的多层视网膜类器官支架，优化iMG在三维基质中的迁移与定植微环境 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 论文实际使用4096通道HD-MEA芯片记录RGC光响应放电，可直接复现该电生理表型验证实验 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 提供动态微流控培养条件，可解决文中提及的iMG长期存活率低与解离丢失问题，维持稳定的炎症因子梯度 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐ | 适用于高通量类器官形态学筛选与免疫荧光自动化成像，辅助评估不同分化批次中iMG的整合效率 |
参考文献
- Douvaras P, Sun B, Wang M, et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia. Stem Cell Reports. 2017;8(6):1516-1524. doi:10.1016/j.stemcr.2017.04.023
- Sridhar A, Hoshino A, Finkbeiner CR, et al. Single-cell transcriptomic comparison of human fetal retina, hPSC-derived retinal organoids, and long-term retinal cultures. Cell Rep. 2020;30(5):1644-1659. doi:10.1016/j.celrep.2020.01.007
- Ormel PR, Vieira de Sa R, van Bodegraven EJ, et al. Microglia innately develop within cerebral organoids. Nat Commun. 2018;9(1):4167. doi:10.1038/s41467-018-06684-2
- Dorgau B, Felemban M, Hilgen G, et al. Decellularised extracellular matrix-derived peptides from neural retina and retinal pigment epithelium enhance the expression of synaptic markers and light responsiveness of human pluripotent stem cell derived retinal organoids. Biomaterials. 2019;199:63-75. doi:10.1016/j.biomaterials.2019.01.036
转发语：视网膜类器官终于补齐了“免疫拼图”。这篇论文把iPSC来源的小胶质细胞精准塞进类器官，不仅没破坏光响应功能，还能在LPS刺激下自动释放IL-10抗炎。做眼病机制和AAV基因治疗安全性的团队可以直接抄作业。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：J Cell Mol Med 2023 视网膜类器官小胶质细胞共培养