可灌注血管化肾脏类器官芯片模型构建与功能验证
Katharina T Kroll, Kimberly A Homan, Sebastien G M Uzel, Mariana M Mata, Kayla J Wolf, Jonathan E Rubins, Jennifer A Lewis | Biofabrication 2024 | DOI: 10.1088/1758-5090/ad5ac0
标签: #类器官芯片 #微流控灌注 #血管吻合 #肾脏疾病模型 #生物打印
一、做什么 🔬
研究背景：肾脏类器官在静态培养下能重现多细胞结构，但缺乏可控制灌注的血管网络，导致药物递送与毒性评估偏离生理状态。现有体外血管化策略多依赖体内宿主血管长入或预成型毛细血管床，难以实现微血管与大血管的管腔连通及稳定血流灌注，限制了其在高通量药物筛选与细胞治疗中的应用。
核心问题：
- 能否在体外芯片中实现肾脏类器官内源微血管与工程化大血管的管腔吻合？
- 趋化因子梯度与基质降解如何调控内皮细胞及基质细胞的迁移速率？
- 吻合后的血管网络能否承受生理级剪切力并实现大分子与红细胞的跨通道灌注？
研究模型：基于明胶-纤维蛋白水凝胶的双通道微流控芯片，集成人胚胎干细胞来源的肾脏类器官与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。
技术路线：
- PDMS密封垫3D打印：定制双通道结构，分别嵌入独立灌注管路。
- 内皮大血管构建：下通道接种HUVECs，旋转培养2天形成连续内皮单层。
- 类器官接种与超灌注：上通道接种第10/11天肾脏类器官，施加0.0581 dyn cm⁻²剪切力促进内皮祖细胞扩增。
- 微-大血管吻合诱导：利用VEGF浓度梯度与基质降解（MMPs）驱动类器官来源微血管向大血管迁移并连接。
- 灌注功能验证：施加9.6 mmHg跨通道压差，注入荧光葡聚糖与红细胞，共聚焦成像追踪灌注路径。
二、发现什么 📊
核心发现1：双通道芯片内工程化大血管形成有效屏障并支持类器官三维成熟
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 下通道接种HUVECs，旋转培养2天后形成连续内皮层；上通道接种肾脏类器官并施加0.0581 dyn cm⁻²剪切力；分别灌注10 kDa、70 kDa、2 MDa荧光葡聚糖30分钟，共聚焦成像评估通透性。 |
| 发现什么 | 无内皮对照组中所有分子量葡聚糖快速渗入基质；内皮化大血管中70 kDa和2 MDa葡聚糖完全滞留于管腔，仅10 kDa分子扩散至周围明胶-纤维蛋白基质。 |
| 说明什么 | 工程化大血管具备生理级选择性屏障功能，排除了通道间非特异性渗漏，为后续微血管吻合与定向灌注提供了结构基础。 |
核心发现2：VEGF梯度与基质降解协同驱动内皮细胞以特定速率向大血管迁移
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在灌注第1-10天，每48小时明场成像记录迁移前沿；对比不同培养基（Adv RPMI、Adv RPMI+10 ng/ml VEGF、EGM-2）及添加1 mg/ml氨基己酸（ACA）条件下的迁移距离，线性回归计算速率。 |
| 发现什么 | 单一Adv RPMI灌注时迁移极少；下通道添加10 ng/ml VEGF后，迁移速率显著提升（p<0.001）；上通道添加ACA抑制基质降解后，迁移速率降至0 μm/d。 |
| 说明什么 | 细胞迁移严格依赖VEGF化学趋化梯度与局部基质重塑能力，证实“内向外”血管化需要微环境降解与促血管生成信号的双重配合。 |
核心发现3：类器官来源微血管网络在迁移过程中发生显著形态重塑与血管标志物上调
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对芯片组织切片进行Angiotool图像分析，量化类器官内部与基质中微血管的总长度与连接点密度；提取组织RNA进行Nanostring nCounter分析，检测血管生成相关基因表达。 |
| 发现什么 | 基质中微血管总长度从第4天到第10天增长约3.2倍，连接点密度下降约40%；ENG、FLT1、NOS3、PECAM1等基因表达较静态对照上调2.1至4.5倍（p<0.0001）。 |
| 说明什么 | 迁移过程伴随活跃的血管出芽与管腔重塑，连接点密度下降提示网络从密集网状向成熟管状结构转化，基因表达谱证实内皮细胞处于活跃的血管生成状态。 |
核心发现4：微-大血管实现管腔吻合并成功实现大分子与红细胞的跨通道定向灌注
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 灌注第10-14天，在上下通道间建立约9.6 mmHg静水压差；分别灌注1 mg/ml 2 MDa荧光葡聚糖（24小时）或5%压积红细胞悬液（16小时）；固定后共聚焦成像与3D重建。 |
| 发现什么 | 2 MDa葡聚糖与CD235a+红细胞均通过吻合口进入基质微血管网络，并富集于PODXL+足细胞簇周围；管腔内荧光信号强度达背景值的4.8倍，组织间隙渗漏率低于8%。 |
| 说明什么 | 微血管与大血管已建立功能性管腔连通，能够承受生理级压力梯度并实现大分子与细胞成分的靶向递送，验证了该模型在药物筛选与细胞治疗中的灌注可行性。 |
三、说明什么 💡
领域意义：传统肾脏类器官芯片受限于静态培养或浅表超灌注，无法模拟体内血流动力学与血管屏障。该研究首次在体外实现“类器官内源微血管-工程化大血管”的管腔吻合，将微流控灌注与类器官自组装结合，确立了体外构建可灌注实体组织的新范式。学界此前认为类器官血管化必须依赖体内移植或预成型毛细血管床，该工作证明通过趋化梯度与基质重塑即可在纯体外环境中完成血管网络整合。
临床/转化价值：
- 为肾毒性药物筛选提供具备血流灌注与血管屏障的体外平台，可更准确评估大分子药物与细胞疗法的组织分布。
- 支持构建疾病特异性血管损伤模型，用于研究糖尿病肾病、高血压肾损害中的内皮功能障碍。
- 为未来器官级组织工程提供可扩展的血管化模块，推动肾脏替代疗法的体外制造。
与我们产品的关联：该研究依赖高精度微流控芯片制造、长期动态灌注与高分辨率三维成像。我们的微流控生物打印平台与活细胞成像系统可直接复现或优化其双通道灌注与血管吻合实验，缩短模型搭建周期。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐ | 论文使用定制多材料3D生物打印机制造PDMS密封垫与ECM通道。BIO X6可替代用于高精度打印双通道微流控模具或直接打印明胶-纤维蛋白水凝胶支架，提升通道几何一致性。 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐ | 本研究聚焦血管灌注与形态学，未涉及电生理记录。若后续需评估灌注肾脏类器官的离子通道活性或神经元-肾脏互作，HD-MEA可提供高通量电生理监测。 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 论文依赖传统倒置共聚焦进行切片成像。Celvivo活细胞成像系统可在不切片条件下对完整芯片进行长期三维动态追踪，实时记录微血管迁移与吻合过程。 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐ | 研究采用静态压差与蠕动泵灌注。SIEVEWELL微流控培养板可集成标准化灌注接口，实现多通道独立流速控制与剪切力精确调节，适合高通量药物灌注测试。 |
参考文献
- Homan KA, Kolesky DB, Skylar-Scott MA, et al. Bioprinting of 3D convoluted renal proximal tubules on perfusable chips. Sci Rep. 2016;6:34845. DOI: 10.1038/srep34845
- Homan KA, Gupta N, Kroll KT, et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nat Methods. 2019;16(3):255-262. DOI: 10.1038/s41592-019-0325-9
- Musah S, Mammoto A, Coburn JM, et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nat Biomed Eng. 2017;1:0069. DOI: 10.1038/s41551-017-0069
- Kroll KT, Gupta N, Kolesky DB, et al. Immune-infiltrated kidney organoid-on-chip model for assessing T cell bispecific antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 2023;120(43):e2305322120. DOI: 10.1073/pnas.2305322120
转发语：体外肾脏类器官终于接上“血管网”了！哈佛团队用双通道芯片实现微血管与大血管管腔吻合，大分子和红细胞能直接灌注到足细胞旁，肾毒性筛选和细胞递送有了新平台。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：Biofabrication 2024 可灌注血管化肾脏类器官芯片模型