人类肝门静脉区类器官组装体在体外重现肝脏组织结构与病理特征
Lei Yuan, Sagarika Dawka, Yohan Kim, Anke Liebert, Fabian Rost, Robert Arnes-Benito, Franziska Baenke, Christina Götz, David Long Hin Tsang, Andrea Schuhmann, Anna Shevchenko, Roberta Rezende de Castro, Seunghee Kim, Aleksandra Sljukic, Anna M. Dowbaj, Andrej Shevchenko, Daniel Seehofer, Dongho Choi, Georg Damm, Daniel E. Stange & Meritxell Huch | Nature 2026 | 10.1038/s41586-025-09884-1
标签: #类器官组装体 #肝脏疾病 #胆管纤维化 #原代肝细胞扩增 #个性化药物筛选 #3D细胞培养
一、做什么 🔬
研究背景：成人原代肝细胞离体后迅速丧失增殖能力，传统二维培养仅能维持数天且无法重现体内三维胆小管网络与细胞极性。现有类器官模型多局限于单一上皮细胞系或诱导多能干细胞来源的未成熟细胞，缺乏肝细胞、胆管细胞与门静脉间质细胞的空间互作，导致药物代谢预测与胆道纤维化机制研究存在显著种属偏差与模型失真。
核心问题：
- 能否在体外实现成人原代肝细胞的长期扩增并维持其成熟代谢功能？
- 肝细胞、胆管细胞与门静脉成纤维细胞能否在三维空间中自组装为具有生理比例与区室化特征的类器官组装体？
- 该多细胞组装体平台能否精准模拟人类胆道纤维化进程中的基质重塑与细胞比例失衡？
研究模型：28名患者来源的原代肝细胞、胆管细胞与门静脉成纤维细胞构建的类器官与组装体，联合Fah-/-免疫缺陷小鼠异种移植模型。
技术路线：
- EpCAM磁珠分选：从新鲜肝组织中分离EpCAM阴性肝细胞与EpCAM阳性胆管细胞
- WNT/YAP通路激活培养：使用WntS与TRULI抑制剂组合（EM2培养基）驱动肝细胞退出静息态
- 分化诱导成熟：撤除YAP激活剂并添加地塞米松（DM培养基）重建细胞极性与代谢功能
- 三细胞比例自组装：按生理比例（肝细胞77%:胆管细胞15%:成纤维细胞8%）在AggreWell微孔板中诱导三维自组装
- 单细胞转录组与异种移植验证：scRNA-seq解析空间区室化特征，小鼠模型验证体内定植与功能代偿
二、发现什么 📊
核心发现1：WNT/YAP通路协同激活突破原代肝细胞体外扩增瓶颈
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在基础培养基（MM）中梯度添加WntS、TRULI（LATS1/2抑制剂）及烟酰胺，测试不同组合对原代肝细胞成球率与传代能力的影响，并进行核型分析 |
| 发现什么 | 单独添加WntS或TRULI仅支持5-6代扩增；联合使用并去除烟酰胺后，形成效率提升近10倍（P=0.0030），连续传代>10代未出现染色体异常，冻存复苏后扩增能力无衰减 |
| 说明什么 | 证实WNT与YAP共激活是驱动成人肝细胞退出终末分化并长期增殖的核心开关，去除烟酰胺消除了已知肝毒性并大幅提升扩增窗口，解决了原代肝细胞无法体外建系的长期技术壁垒 |
核心发现2：撤除YAP激活剂并添加地塞米松驱动肝细胞成熟与功能重建
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 构建DM培养基（撤除TRULI，保留WNT信号，添加地塞米松），对扩增期与分化期类器官进行RNA-seq、qPCR与免疫荧光染色，对比原代肝细胞与胆管类器官的转录组差异 |
| 发现什么 | DM组Ki-67信号显著减弱，HNF4A/ALB表达量接近新鲜PHH水平；CYP3A4、CYP2C9、ABCC2等成熟代谢与转运基因显著上调（NES=1.82，adj.P=0.004），胚胎标志物AFP与胆管标志物KRT19/KRT7表达量下降60%以上 |
| 说明什么 | YAP抑制是肝细胞重获成熟表型的必要条件，DM成功逆转了扩增期的去分化状态，使类器官从“增殖态”平稳过渡至“功能态”，为后续多细胞互作研究提供成熟细胞基础 |
核心发现3：分化后类器官重建体内级联状胆小管网络并具备完整代谢解毒能力
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 利用3D图像重构技术分析CD13+胆小管网络厚度与分支连通性，检测CYP450酶活性、白蛋白分泌量，并通过质谱定量维拉帕米向去甲维拉帕米的转化率 |
| 发现什么 | DM组胆小管局部厚度更均匀，连接点数量显著增加（P=0.0103）；白蛋白分泌量与7天原代肝细胞无统计学差异（P=0.5995）；CYP2C9活性等效于7d-PHH，去甲维拉帕米产量显著高于1d-PHH（P=0.0188），且不同供体间代谢速率差异达3.2倍 |
| 说明什么 | 成熟类器官不仅恢复细胞顶-基底极性，更具备与体内组织等效的药物代谢动力学特征，供体间代谢差异的保留证明该平台可直接用于个体化药代动力学评估与毒性预测 |
核心发现4：肝细胞、胆管细胞与门静脉成纤维细胞按生理比例自组装为门静脉区微结构
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将荧光标记的胆管细胞、门静脉成纤维细胞与未标记肝细胞按不同比例混合于96孔板与AggreWell板中，通过流式分选与scRNA-seq分析细胞组成，检测尿素合成与糖异生功能 |
| 发现什么 | 1:25:100（肝:成纤维:胆管）比例下组装效率达80%以上，细胞比例与体内组织高度一致；scRNA-seq显示组装体肝细胞中门静脉区标志物SAA1/SAA2表达上调，中央静脉标志物CYP2E1下调；尿素合成量显著高于单培养肝细胞（P=0.0020） |
| 说明什么 | 细胞间物理接触与旁分泌信号成功诱导肝细胞区室化重编程，体外重现了门静脉区的空间转录组特征与代谢协同效应，证明三细胞组装体可替代传统单层共培养用于复杂微环境研究 |
核心发现5：组装体平台精准模拟胆道纤维化进程中的细胞比例失衡与基质重塑
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在稳态组装体中施加促纤维化刺激，培养10天后进行单细胞聚类分析、GSEA通路富集与免疫荧光染色，对比稳态与纤维化样结构的细胞比例与基因表达谱 |
| 发现什么 | 间质细胞异常增殖，胆管上皮显著萎缩；GSEA显示细胞外基质组装（NES=2.1）、TGF-β响应（NES=1.8）及胶原生物合成通路显著激活（adj.P<0.01）；KRT19+胆管结构断裂，Vimentin+成纤维细胞向胆管基底侧延伸并形成致密胶原沉积 |
| 说明什么 | 该组装体完整保留了纤维化微环境中的细胞互作与基质沉积动态，病理表型与临床肝硬化组织高度吻合，为抗纤维化靶点验证与药物筛选提供高保真、可量化的体外模型 |
核心发现6：异种移植验证扩增类器官的体内定植能力与患者特异性代谢表型保留
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将EM2/DM组类器官脾内注射至Fah-/-Rag2-/-Il2rg-/-免疫缺陷小鼠，记录生存曲线，检测移植物人源白蛋白表达，并比对患者原代肝细胞与匹配类器官的转录组特征 |
| 发现什么 | 移植组小鼠存活率显著高于假手术组（P=0.0127），移植物在肝实质中广泛定植并分泌人源白蛋白；类器官与原代细胞转录组相关性R²=0.7-0.9，GST、LDHC、APOA4等代谢与疾病易感基因在体外培养中未发生遗传漂变 |
| 说明什么 | 体外扩增的肝细胞未丧失体内功能代偿潜力，且完整保留了供体特异性分子指纹，证明该平台可直接用于构建患者特异性疾病活体生物样本库，支撑精准医疗与早期诊断研究 |
三、说明什么 💡
领域意义：该研究彻底打破了“成人原代肝细胞离体即终末分化、无法长期扩增”的传统认知，确立了WNT激活与YAP抑制的时序调控轴是肝细胞体外命运转换的核心机制。学界此前依赖iPSC来源的未成熟肝细胞或鼠源类器官，存在显著的种属代谢差异与区室化缺失；本研究证明患者来源的三细胞组装体可在体外精确重现门静脉区的空间转录组特征与细胞互作网络，将肝脏体外建模从“单一上皮增殖”推向“多细胞微环境重构”的新共识。
临床/转化价值：
- 建立患者特异性药物代谢动力学预测平台，直接评估CYP450酶活性个体差异，降低临床试验期肝毒性风险
- 提供胆道纤维化与胆汁淤积性疾病的动态病理模型，支持抗纤维化小分子与靶向抗体的早期高通量筛选
- 替代部分动物实验，利用人源组装体解析种属特异性毒性机制，加速肝脏疾病新药IND申报进程
与我们产品的关联：
- 该研究依赖长期三维培养与多细胞比例自组装，对培养基渗透压、气体交换与剪切力控制要求极高
- 若需将组装体从微孔板转移至标准化高通量筛选体系，或进行长期无换液培养，需依赖自动化生物打印与微流控灌注设备
- 产品可填补组装体规模化构建、长期稳态维持与高通量药筛环节的硬件空白
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐ | 组装体从AggreWell向标准化96/384孔板的转移与生物墨水包埋，实现多细胞比例的精准空间排布与高通量构建 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐ | 监测组装体在药物刺激下的离子通道波动与代谢微电流变化，辅助评估肝毒性早期电生理信号（非核心但具探索价值） |
| Celvivo | ⭐⭐⭐⭐ | 提供无换液、低剪切力的长期三维培养环境，维持组装体>14天的稳态代谢与细胞比例，直接替代文中频繁换液操作 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐⭐ | 承接组装体规模化扩增后的药物代谢与毒性高通量筛选，兼容3D类器官的成像与终点检测流程 |
星级定义：
⭐⭐⭐⭐⭐ = 核心工具（论文里实际用了，或可直接替代）
⭐⭐⭐ = 配套使用（同一技术路线，我们的产品能做类似的事）
⭐⭐ = 潜在应用（方向相关，但需要客户自己建立方法）
⭐ = 勉强相关（同一领域，但产品线不直接覆盖）
参考文献
- Yuan L, Dawka S, Kim Y, Liebert A, Rost F, Arnes-Benito R, Baenke F, Götz C, Tsang DLH, Schuhmann A, Shevchenko A, de Castro RR, Kim S, Sljukic A, Dowbaj AM, Shevchenko A, Seehofer D, Choi D, Damm G, Stange DE, Huch M. Human assembloids recapitulate periportal liver tissue in vitro. Nature. 2026. 10.1038/s41586-025-09884-1
- Broutier L, Andersson-Rolf A, Hindley CJ, Koo SJ, Huch M, Kujala P, Snippert HJ, Clevers H, Koo BK. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modelling and drug screening. Nat Med. 2017. 10.1038/nm.4438
- Hu H, Gehart H, Artegiani B, López-Iglesias C, Dekkers F, Basak O, van Boxtel R, Armbrust VM, Cuppen E, Begthel H, Korving J, van den Born M, Zou J, Clevers H. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 2018. 10.1016/j.cell.2018.11.013
- Takebe T, Sekine K, Enomura M, Koike H, Kimura M, Ogaeri T, Urrutia S, Ku YC, Ueno Y, Zheng YW, Taniguchi H. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 2013. 10.1038/nature12271
转发语：原代肝细胞终于能在体外长期扩增了！Nature最新工作用WNT/YAP组合拳+三细胞自组装，把人类肝门静脉区微环境1:1搬到培养皿，胆道纤维化建模和个体化药筛直接提速。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：Nature 2026 Human assembloids recapitulate periportal liver tissue