人多能干细胞体外自组装生成带毛囊的人类皮肤类器官
Jiyoon Lee, Cyrus C. Rabbani, Hongyu Gao, Matthew R. Steinhart, Benjamin M. Woodruff, Zachary E. Pflum, Alexander Kim, Stefan Heller, Yunlong Liu, Taha Z. Shipchandler, Karl R. Koehler | Nature 2020 | 10.1038/s41586-020-2352-3
标签: #类器官培养 #皮肤再生 #毛囊发育 #单细胞测序 #神经支配
一、做什么 🔬
研究背景：体外重建具备完整附属器（毛囊、皮脂腺、神经末梢）的人类皮肤长期面临技术瓶颈。传统二维共培养或简单三维基质胶模型仅能生成扁平表皮或无序真皮，无法重现胚胎期表皮-真皮双向信号传导与毛囊周期性空间排布。该领域亟需一种能够自组织、具备多层结构与功能神经支配的三维皮肤模型，以支撑发育机制解析与再生医学应用。
核心问题：
- 能否通过时序调控TGFβ与FGF信号通路，从人多能干细胞同步诱导表面外胚层与颅神经嵴细胞？
- 体外自组装的皮肤类器官在细胞谱系组成上是否匹配人类胚胎期颅面皮肤？
- 类器官毛囊能否自发形成色素沉着、神经支配及触觉感受器雏形？
- 囊状类器官移植至活体后能否展开为平面皮肤并整合宿主血管与微环境？
研究模型：人多能干细胞（WA25 hESC、DSP-GFP hiPSC、WA01 hESC）衍生的三维球形聚集体，经4-5个月悬浮培养形成皮肤类器官，并异种移植至免疫缺陷裸鼠背部。
技术路线：
- 3D微球聚集与外胚层诱导：单细胞悬液于U底96孔板离心聚集，添加BMP-4与TGFβ抑制剂SB431542启动非神经外胚层分化。
- 颅神经嵴细胞共诱导：第3天联合添加BMP抑制剂LDN-193189与bFGF，促使间充质前体细胞包裹上皮囊。
- 动态悬浮长期成熟：转移至低吸附24孔板，65 rpm轨道摇床悬浮培养，维持营养交换并促进自组织。
- 单细胞转录组时序解析：第6、29、48天取样进行10x Genomics scRNA-seq，追踪谱系演变与表皮-真皮互作网络。
- 裸鼠异种移植验证：切除类器官非皮肤软骨尾部，植入裸鼠背部1-2 mm切口，评估体内整合与毛囊成熟度。
二、发现什么 📊
核心发现1：时序信号调控驱动表皮与真皮前体共诱导，高效生成带毛囊的囊状类器官
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对比第3天不添加抑制剂、仅加LDN、LDN/FGF联用三种条件，在U底96孔板培养至第120天，通过免疫荧光（LHX2/PCAD/EDAR标记表皮生发层，SOX2/PDGFRα/P75标记真皮乳头）与明场成像定量毛囊发生率与数量。 |
| 发现什么 | LDN/FGF联用组毛囊发生率稳定在87.4%（WA25，n=212，范围68.8%-100%）与87.2%（DSP-GFP，n=212，范围66.7%-100%）；单类器官平均含64个（WA25，范围9-285）与48个（DSP-GFP，范围7-128）毛囊；毛囊呈周期性空间排布，真皮乳头细胞簇100%表达SOX2。 |
| 说明什么 | 证明单一信号通路无法驱动完整皮肤形态发生，必须通过第3天精确窗口期共诱导颅神经嵴来源的间充质细胞包裹上皮囊，才能触发类似哺乳动物的毛囊发生程序与空间模式化。 |
核心发现2：单细胞转录组揭示类器官具备明确的颅面皮肤身份与表皮-真皮互作网络
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对第6天（23,329个细胞）与第29天（18,190个细胞）的WA25与DSP-GFP类器官进行10x Genomics 3' scRNA-seq，Seurat整合分析后进行UMAP降维聚类与差异基因注释。 |
| 发现什么 | 第6天细胞群分为上皮（59%）、神经胶质（8%）、间充质（8%）与增殖期（25%）；第29天间充质占比升至70%，上皮降至17%；间充质亚群高表达PRRX1、TRIL、TWIST2及DLX家族基因，同时PITX1、BARX1、GSC、HAND2阳性，HOX基因家族完全沉默；表皮层表达FGF7（KGF），真皮层表达SFRP2、TCF4、WIF1。 |
| 说明什么 | 证实类器官在发育早期即建立明确的颅面（下颌/颊/外耳）解剖身份，排除躯干或尾部皮肤特征；表皮分泌FGF7与真皮分泌WNT抑制因子构成双向旁分泌轴，驱动表皮分层与真皮基质沉积。 |
核心发现3：类器官自发形成色素毛囊与触觉神经回路，结构匹配妊娠18周胎儿皮肤
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 培养>100天后进行透射电镜观察黑素小体，免疫荧光标记PMEL（黑素细胞）、ISL1/TUJ1（神经元）、S100β（施万细胞）、KRT20（默克尔细胞），统计色素毛囊比例与神经支配覆盖率。 |
| 发现什么 | 色素毛囊发生率WA25为53.5%（n=137），DSP-GFP为76.2%（n=91）（p=0.077）；100%类器官（>30个，7次独立实验）出现NEFH+假单极神经元与S100β+施万细胞形成的神经束；神经末梢100%环绕毛囊外根鞘，KRT20+默克尔细胞定位于神经靶向区域；电镜确认表皮与毛囊基质内存在成熟黑素小体。 |
| 说明什么 | 证明体外自组装不仅生成结构附属器，还能重建初级机械触觉传导通路；神经-毛囊-黑素细胞的空间耦合程度与妊娠中期人类胎儿皮肤高度一致，为研究感觉神经发育提供原位模型。 |
核心发现4：异种移植后类器官展开为平面皮肤，整合宿主血管并保留毛囊干细胞库
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 培养第140天切除软骨尾部，将含毛囊类器官植入裸鼠背部1-2 mm切口，7-14周后取材进行H&E染色、CD49f血管标记、SCD1皮脂腺标记及KRT15/LHX2/NFATC1干细胞标记分析。 |
| 发现什么 | 55%（15/27）移植物长出2-5 mm垂直向外毛发，22%内卷，22%技术失败；组织学显示移植物表皮与宿主表皮完全融合，形成角质层与网状嵴结构；CD49f+宿主血管长入移植物；100%外生毛囊检出多叶状SCD1+皮脂腺与含脂质空泡的皮脂细胞；隆突区100%表达KRT15+/LHX2+/NFATC1+干细胞标志物（NFATC1呈胞质分布）。 |
| 说明什么 | 囊状类器官具备体内展开与微环境整合能力，宿主血管化与神经支配可进一步驱动附属器成熟；隆突干细胞库的保留证明该模型具备长期再生潜力，为烧伤/创伤修复提供带附属器的自体皮肤替代方案。 |
三、说明什么 💡
领域意义：该研究将皮肤类器官从“细胞混合共培养”推进至“多谱系自组织”阶段。过去学界认为毛囊发生必须依赖体内胚胎微环境或复杂的二维共培养支架，该论文证明仅需精确的时序生长因子调控与3D悬浮培养，人多能干细胞即可自发重建表皮-真皮-毛囊-神经-色素的完整拓扑结构。单细胞数据与胎儿组织的直接比对确立了该模型在发育生物学中的基准地位，同时暴露出缺乏朗格汉斯细胞与汗腺的局限性，为后续免疫微环境重建指明方向。
临床/转化价值：
- 遗传性皮肤病建模：利用患者来源iPSC可体外重现大疱性表皮松解症、先天性少汗症等疾病的毛囊与表皮缺陷，缩短药物筛选周期。
- 创伤修复与再生外科：移植后平面化整合与血管化能力证明其可作为带毛囊的复合皮片，用于深度烧伤或慢性溃疡的功能性覆盖。
- 化妆品与毒理测试：具备完整角质层屏障、皮脂腺分泌与神经末梢的类器官可替代动物实验，用于评估透皮吸收、光老化与神经毒性。
与我们产品的关联：
- 论文采用U底96孔板与轨道摇床进行长期悬浮培养，存在中心营养梯度不均与批次差异问题。引入微流控动态培养系统可稳定剪切力与代谢物清除，提升类器官成熟一致性。
- 触觉神经回路的电生理功能尚未在体外量化，高密度微电极阵列可直接记录类器官神经元对机械刺激的放电频率，填补功能验证空白。
- 移植前类器官的形态学筛选与毛囊定量依赖人工计数，高通量成像与自动化分析可加速标准化质控流程。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐ | 用于类器官标准化成型与移植前生物墨水封装，替代传统U底孔板实现高通量、均一化类器官阵列制备，降低批次变异。 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐⭐ | 论文证实类器官具备ISL1+假单极神经元与默克尔细胞触觉回路，可用HD-MEA实时记录机械刺激诱发的动作电位频率与神经传导速度。 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐⭐ | 替代传统摇床提供4-5个月长期动态悬浮培养环境，微流控灌注维持稳定氧分压与营养梯度，减少囊状类器官中心坏死，提升毛囊发生率。 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐ | 用于移植前类器官的高内涵成像与毛囊/色素定量分析，或用于异种移植后皮肤切片的自动化组织学特征提取与质控。 |
参考文献
- Lee J, Rabbani CC, Gao H, et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 2020;582(7812):399-404. DOI: 10.1038/s41586-020-2352-3
- Koehler KR, Mikosz AM, Molosh AI, et al. Generation of inner ear hair cells by direct differentiation of human pluripotent stem cells. Nature. 2013;495(7440):217-221. DOI: 10.1038/nature11922
- Lee J, Rabbani CC, Gao H, et al. Single-cell transcriptomic atlas of human skin organoid development. bioRxiv. 2020. DOI: 10.1101/2020.05.15.097856
- Plikus MV, Guerrero-Juarez CF, Ito M, et al. Morphoregulation of hair follicle stem cells. Cell Stem Cell. 2017;20(5):633-647. DOI: 10.1016/j.stem.2017.04.004
- Rabbani CC, Tan LL, Joshi S, et al. Vascularized human skin equivalent model for wound healing and disease modeling. Nat Commun. 2021;12:5892. DOI: 10.1038/s41467-021-26167-4
转发语：人多能干细胞在体外直接“长”出带毛囊、神经和色素的完整皮肤，移植裸鼠后还能整合血管并长出2-5mm真毛发，再生医学和皮肤药筛的底层工具又往前跨了一大步。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：Nature 2020 Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent