靶向反义寡核苷酸治疗挽救脊髓性肌萎缩症类器官发育异常
Irene Faravelli, Paola Rinchetti, Monica Tambalo, Illia Simutin, Lisa Mapelli, Sara Mancinelli, Matteo Miotto, Mafalda Rizzuti, Andrea D’Angelo, Chiara Cordiglieri, Giulia Forotti, Clelia Peano, Paolo Kunderfranco, Luca Calandriello, Giacomo P. Comi, Elvezia Paraboschi, Eleonora Pali, Francesca Beatrice, Egidio D’Angelo, Serge Przedborski, Monica Nizzardo, Simona Lodato, Stefania Corti | Nature Communications 2026 | 10.1038/s41467-025-67725-1
标签: #脊髓性肌萎缩症 #脊髓类器官 #多电极阵列 #反义寡核苷酸 #单细胞转录组 #神经发育
一、做什么 🔬
研究背景：脊髓性肌萎缩症（SMA）由SMN1基因突变引发，传统认知聚焦于出生后运动神经元退化。现有获批疗法（ASO、基因替代）在症状前干预效果最佳，但早期胚胎期全中枢神经系统的发育停滞机制与剪接异常网络尚未被系统解析。二维培养与动物模型无法还原人类多细胞互作与遗传背景，限制了对疾病早期窗口的精准评估。
核心问题：
- SMN缺失如何重塑脊髓类器官中神经前体细胞向成熟神经元的发育轨迹？
- SMA类器官的电生理网络是否呈现跨脑区与脊髓的广泛性过度兴奋特征？
- 早期给予优化型反义寡核苷酸能否同步逆转形态缺陷、电生理异常与转录组剪接紊乱？
研究模型：5名健康对照与5名SMA 1型患者iPSC衍生的脊髓类器官（SCOs）与大脑类器官（CrOs）。
技术路线：
- 定向分化培养：利用Wnt/RA/SHH通路小分子诱导iPSC向脊髓/大脑类器官分化至2月龄。
- 单细胞转录组测序：解析27,114个细胞的亚群组成、差异丰度与拟时序发育轨迹。
- 高密度多电极阵列（HD-MEA）：记录基础放电频率与谷氨酸刺激后的网络电生理响应。
- 优化型ASO干预：使用精氨酸偶联吗啉代寡核苷酸（r6-MO）靶向SMN2进行早期给药。
- RNA深度测序与剪接分析：量化r6-MO对全转录组差异表达及2,614个可变剪接事件的纠正效率。
二、发现什么 📊
核心发现1：SMN缺失导致脊髓类器官细胞组成失衡，运动神经元显著减少且前体细胞转录程序广泛失调
图1：单细胞测序27,114个细胞显示SMA组运动神经元丰度显著下降，前体细胞群富集，运动神经元簇内2031个基因差异表达（772个上调，1259个下调）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对2月龄健康对照与SMA 1型脊髓类器官进行10x Genomics单细胞转录组测序，使用MiloPy框架进行微环境差异丰度检验，并提取运动神经元簇进行差异基因分析。 |
| 发现什么 | SMA组运动神经元数量显著低于对照组；前体细胞（pMN等）相对富集。运动神经元簇内检出2031个差异表达基因（772个上调，1259个下调），前体细胞中ASCL1与SOX4表达下调，凋亡相关基因CASP9上调。 |
| 说明什么 | SMA病理并非单纯的运动神经元晚期死亡，而是从神经前体阶段即发生细胞命运分配失衡与转录网络紊乱，打破了既往“仅关注成熟神经元退化”的单一视角。 |
核心发现2：SMA前体细胞分化停滞，细胞成熟度显著降低，2月龄时凋亡率急剧攀升
图2：对照组SOX2+细胞比例从47.57%降至20.40%，TUJ1+从13.52%升至28.42%；SMA组SOX2+仅降至25.44%，TUJ1+反降至13.84%，2月龄凋亡率达23.02%（对照组7.37%，p<0.0001）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 利用高内涵成像系统纵向追踪1至2月龄类器官中SOX2（前体）与TUJ1（成熟神经元）阳性细胞比例变化，结合TUNEL染色定量凋亡率，并使用CytoTRACE/CellRank进行拟时序排序。 |
| 发现什么 | 对照组SOX2+比例下降27.17%，TUJ1+上升14.90%；SMA组SOX2+仅下降13.35%，TUJ1+下降7.65%。2月龄时SMA组凋亡细胞占比达23.02%±11.34%，显著高于对照组的7.37%±5.13%（p<0.0001）。拟时序分布KS检验p=2.16e-08。 |
| 说明什么 | SMA神经发育在中间态发生“刹车”，细胞无法顺利向成熟神经元推进，停滞状态直接触发大规模程序性死亡，证实发育停滞是神经元丢失的上游核心事件。 |
核心发现3：运动神经元发育轨迹极化，关键转录因子调控网络紊乱，伴随突触成熟基因下调与轴突生长受损
图3：扩散映射显示SMA运动神经元轨迹极化，SOX2调控子活性持续维持；SMA神经元神经突起长度34.62±8.34 μm，显著短于对照组59.17±12.30 μm（p<0.0001）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 提取运动神经元谱系进行扩散映射（Diffusion Map）与拟时序轨迹分析，使用pySCENIC推断转录因子调控子活性，并通过SMI32染色定量神经突起长度。 |
| 发现什么 | SMA组轨迹呈现两极分化，大量细胞堆积于前体态与中间态。SOX2、PHOX2B、CHD2等关键调控子活性谱发生偏移，SOX2程序持续激活。SMA神经元突起长度缩短至对照组的58.5%（34.62 μm vs 59.17 μm，p<0.0001）。 |
| 说明什么 | SMN缺失直接破坏运动神经元命运决定的转录级联反应，导致轴突延伸与突触成熟程序提前中断，为后续电生理网络构建失败提供结构基础。 |
核心发现4：脊髓与大脑类器官均呈现基础放电减弱与谷氨酸诱导的过度兴奋，证实CNS广泛电生理缺陷
图4：脊髓类器官基础放电SMA组1.355±0.68 Hz低于对照1.956±0.54 Hz（p=0.0127），谷氨酸刺激后SMA组放电增幅91.03%±28.42%，远超对照44.06%±20.03%（p<0.0001）；大脑类器官呈现相同趋势。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将2月龄脊髓与大脑类器官转移至高密度多电极阵列（HD-MEA）芯片，记录基础自发尖峰频率，灌注谷氨酸后量化网络放电相对变化率，并阻断GABA-A/甘氨酸受体验证抑制性环路完整性。 |
| 发现什么 | 脊髓类器官：SMA基础频率较对照降低30.7%（1.355 Hz vs 1.956 Hz，p=0.0127）；谷氨酸刺激后SMA增幅达91.03%，对照仅44.06%（p<0.0001）。大脑类器官：SMA基础频率0.85 Hz vs 对照2.21 Hz（p<0.0001）；谷氨酸增幅115.3% vs 39.11%（p<0.0001）。抑制性阻断后两组反应一致。 |
| 说明什么 | SMA病理具有全中枢神经系统属性，非单纯脊髓继发损伤。谷氨酸能突触传递成熟障碍导致网络代偿性过度兴奋，该表型可作为早期药效评价的客观功能终点。 |
核心发现5：早期r6-MO干预显著提升SMN蛋白水平，完全恢复神经元分化表型并逆转过度兴奋
图5：r6-MO处理使TUJ1+细胞比例升至33.93%±7.65%（未处理20.99%，p=0.0003），凋亡率降至10.58%±3.37%（未处理18.16%，p=0.005），基础放电恢复至1.843±0.44 Hz（p<0.0001），谷氨酸过度反应降至44.76%±12.81%（p<0.0001）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在分化第45天起对SMA脊髓类器官进行三次递增剂量r6-MO（精氨酸偶联吗啉代ASO）给药，48小时后通过免疫荧光、TUNEL染色与HD-MEA记录评估形态、存活与电生理恢复情况。 |
| 发现什么 | r6-MO组TUJ1+比例较未处理组提升61.6%（33.93% vs 20.99%，p=0.0003）。凋亡率下降41.7%（10.58% vs 18.16%，p=0.005）。基础放电频率恢复至1.843 Hz（未处理1.067 Hz，p<0.0001）。谷氨酸刺激增幅从98.31%降至44.76%（p<0.0001）。 |
| 说明什么 | 优化递送系统的ASO在发育关键窗口给药可穿透类器官核心，同步挽救细胞命运停滞、降低异常死亡并重塑网络电生理稳态，验证了早期靶向干预的临床转化潜力。 |
核心发现6：r6-MO精准纠正2614个异常剪接事件，恢复染色质重塑与轴突导向关键基因的剪接谱
图6：RNA-seq鉴定出2,614个被r6-MO特异性修正的剪接事件，98个基因剪接谱完全恢复至对照水平，CHD9与HDAC6等关键靶点外显子跳跃率显著回调。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对对照组、未处理SMA组与r6-MO处理SMA组进行Bulk RNA深度测序，使用rMATS等工具量化外显子跳跃、互斥外显子、内含子保留等可变剪接事件，并与单细胞模块进行交叉映射。 |
| 发现什么 | r6-MO特异性修正2,614个剪接事件（以SE、MXE、IR为主）。交集分析锁定98个基因剪接谱完全恢复至健康对照水平。GO富集指向染色质组织、DNA代谢与轴突导向。CHD9与HDAC6的异常剪接被精准回调。 |
| 说明什么 | SMN恢复的核心机制在于重建发育关键节点的转录后剪接网络，而非全局转录重编程。剪接修复直接驱动染色质重塑与轴突导向通路正常化，为ASO疗效提供分子级解释。 |
三、说明什么 💡
领域意义：该研究将SMA病理认知从“出生后运动神经元退化”前移至“胚胎期全中枢发育停滞与剪接网络崩溃”。单细胞轨迹与电生理数据共同证实，SMN缺失在神经元成熟前即引发前体细胞命运分配失衡与谷氨酸能网络过度兴奋。早期ASO干预可同步逆转形态、功能与剪接缺陷，确立“发育窗口期”为治疗黄金期。学界对SMA是否累及大脑皮层的争议被类器官电生理数据直接平息，CNS广泛受累成为新共识。
临床/转化价值：
- 确立症状前干预的绝对必要性，提示新生儿筛查后需立即启动ASO或基因治疗。
- 提供HD-MEA电生理表型与特定剪接事件（如CHD9、HDAC6）作为早期药效监测的客观生物标志物。
- 优化递送系统（如细胞穿透肽偶联）可突破血脑屏障与组织渗透瓶颈，为下一代核酸药物设计提供模板。
与我们产品的关联：
- 论文核心依赖HD-MEA进行网络级功能评价，3Brain平台可直接复现该电生理筛选流程。
- 类器官标准化培养与高通量给药依赖稳定微环境，Cellink生物打印与自动化培养系统可提升批次一致性。
- 长期活细胞成像与凋亡动态追踪可结合Celvivo系统实现无标记监测。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐ | 用于SMA类器官的高通量标准化制备与多条件并行培养，提升不同ASO浓度梯度测试的批次一致性。 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 论文核心功能评价工具。可直接用于SMA类器官基础放电、谷氨酸刺激响应及ASO干预后的网络电生理药效筛选。 |
| Celvivo | ⭐⭐ | 支持类器官长期无标记活细胞成像，适用于追踪SOX2/TUJ1比例动态变化与凋亡发生的时间窗。 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐ | 微流控环境可模拟类器官营养梯度与药物渗透动力学，辅助优化r6-MO等大分子ASO的递送效率测试。 |
参考文献
- Faravelli I, Rinchetti P, Tambalo M, et al. Targeted antisense oligonucleotide treatment rescues developmental alterations in spinal muscular atrophy organoids. Nature Communications. 2026. DOI: 10.1038/s41467-025-67725-1
- Wirth B, Brichta L, Karakaya M, et al. Twenty-five years of spinal muscular atrophy research: from phenotype to therapy. Brain. 2020. DOI: 10.1093/brain/awaa245
- Lancaster MA, Knoblich JA. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 2014. DOI: 10.1038/nprot.2014.145
- Obien SUJ, Deligkaris K, Bullmann T, et al. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 2015. DOI: 10.3389/fnins.2014.00423
- Hua Y, Vickers TA, Okunola HL, et al. Antisense masking of an hnRNP A1/A2 intronic splicing silencer corrects SMN2 splicing in transgenic mice. American Journal of Human Genetics. 2008. DOI: 10.1016/j.ajhg.2008.02.014
转发语：SMA不只是运动神经元退化，而是胚胎期全脑发育“卡壳”。这篇Nature子刊用类器官+MEA实锤了早期ASO能一键重启剪接网络，电生理表型直接拉回正常值。做神经退行性疾病药效筛选的同行可以重点关注。
联系人：李东伟
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