PRPF31突变导致剪接与纤毛发生基因异常剪接引发视网膜色素变性
Adriana Buskin, Lorraine A. Williams, Sushma N. Grellscheid, ... | Nature Communications 2018 | DOI: 10.1038/s41467-018-06448-y
标签: #视网膜类器官 #前体mRNA剪接 #纤毛发生 #基因编辑 #多电极阵列 #视网膜色素上皮
一、做什么 🔬
研究背景：PRPF31等前体mRNA加工因子（PRPFs）突变会导致常染色体显性遗传的视网膜色素变性（RP11）。PRPFs在全身广泛表达，但突变仅引发视网膜特异性退行性病变，其组织特异性致病机制长期不明。传统动物模型难以复现人类晚期RPE与光感受器表型，缺乏能精准模拟人类剪接缺陷与细胞互作的体外体系。
核心问题：
- 能否在患者来源的视网膜细胞中重现PRPF31突变导致的特异性剪接程序紊乱？
- 异常剪接如何具体影响视网膜色素上皮（RPE）的极性屏障与光感受器的纤毛结构？
- 原位基因编辑能否逆转由剪接缺陷引发的细胞功能衰退？
研究模型：4名不同临床严重程度的RP11患者及3名健康对照的iPSC来源RPE细胞与3D视网膜类器官，辅以Prpf31+/-小鼠视网膜/RPE组织。
技术路线：
- iPSC定向分化：利用小分子诱导方案将患者/对照iPSC分化为RPE单层与3D视网膜类器官
- 转录组与剪接分析：RNA-seq结合rMATS算法定量外显子跳跃、内含子保留等差异剪接事件
- E1A报告基因剪接检测：慢病毒转染含多5'剪接位点的E1A微基因，通过变性PAGE评估剪接效率
- 多电极阵列（MEA）电生理记录：将21周类器官贴附于MEA芯片，记录神经节细胞对GABA/cGMP的放电响应
- 超微结构与纤毛成像：透射电镜（TEM）、序列块面扫描电镜（SBFSEM）与结构光照明显微镜（SIM）解析纤毛微管排列与过渡区蛋白定位
二、发现什么 📊
核心发现1：PRPF31突变导致RPE细胞极性丧失与屏障吞噬功能衰退
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在第21周分化节点，对WT与RP11（S/VS表型）来源的RPE进行免疫荧光（BEST1/MERTK/Collagen IV）、ELISA（顶/基底侧PEDF与VEGF分泌）、TER测定及吞噬功能流式检测 |
| 发现什么 | 重度患者RPE的TER从对照的~1500 Ω·cm²降至~500 Ω·cm²（p<0.0001）；吞噬MFI从300降至100（p<0.001）；顶侧PEDF分泌异常升高，基底侧VEGF分泌显著增加；MERTK与Collagen IV极性分布紊乱 |
| 说明什么 | 证明PRPF31单倍剂量不足直接破坏RPE顶-基底极性与紧密连接，导致屏障通透性增加与吞噬清除能力下降，为RP早期RPE功能障碍提供直接细胞学证据 |
核心发现2：视网膜类器官呈现进行性光感受器凋亡与神经网络响应减弱
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对21周与43周类器官进行TEM超微结构计数，并将类器官贴附于MEA芯片，记录8-Br-cGMP与GABA刺激下的动作电位发放频率 |
| 发现什么 | 突变类器官凋亡核比例较对照增加150%（50个切片统计）；17%切片检出应激空泡；GABA刺激后放电频率较对照下降约60%（p<0.001），而8-Br-cGMP响应无显著差异 |
| 说明什么 | 揭示光感受器退行性变伴随早期神经环路发育受损，GABA能信号传导障碍提示类器官内部突触连接网络建立受阻，而非单纯的光转导通路缺陷 |
核心发现3：PRPF31表达下调引发剪接体组装效率全面下降
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 半定量RT-PCR与Western blot检测PRPF31 WT/LM/SM转录本与蛋白；转染E1A微基因报告系统；Northern blot定量U1/U2/U4/U5/U6 snRNA水平 |
| 发现什么 | RPE中PRPF31 WT蛋白降至对照的16%，类器官降至42%；E1A剪接产物中9S/10S条带灰度值下降>50%，前体mRNA显著堆积；类器官U4 snRNA相对量较对照下降约40% |
| 说明什么 | 证实PRPF31突变通过无义介导的mRNA降解逃逸产生截短蛋白，直接削弱U4/U6.U5三小核核糖核蛋白复合体稳定性，导致全局剪接动力学迟缓 |
核心发现4：转录组揭示剪接机器与纤毛发生基因发生特异性内含子滞留
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对成纤维细胞、iPSC、RPE与类器官进行RNA-seq，利用rMATS计算差异外显子使用率（padj<0.05，ΔInclusion>5%）；RT-PCR验证关键靶基因PSI值 |
| 发现什么 | RPE中RI事件占比最高（~25%）；GO富集显示剪接体组装与纤毛发生通路显著异常；CPSF1 PSI从58%升至89%，CNOT3从74%降至63%；类器官中RPGR、RPGRIP1L、IFT122剪接模式显著偏移 |
| 说明什么 | 剪接缺陷并非随机分布，而是高度富集于维持剪接体自身稳态与纤毛结构蛋白的转录本，形成“剪接缺陷-靶基因异常-剪接体进一步受损”的正反馈恶性循环 |
核心发现5：RPE与光感受器初级纤毛长度缩短且微管排列紊乱
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | ARL13B与Pericentrin免疫荧光共染定量纤毛长度与发生率；2D TEM与3D SBFSEM三维重建观察纤毛超微结构 |
| 发现什么 | RPE纤毛平均长度由对照的~3.0 μm降至~1.5 μm（p<0.0001），发生率由90%降至40%；光感受器连接纤毛同样缩短且发生率下降；电镜显示轴丝微管排列松散、末端膨大 |
| 说明什么 | 纤毛结构完整性高度依赖精确的mRNA剪接程序，PRPF31缺陷直接导致纤毛发生与维持障碍，解释了光感受器外节盘膜更新受阻的形态学基础 |
核心发现6：PRPF31敲低重现纤毛定位异常与SHH信号传导受损
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在hTERT-RPE1细胞中转染siPRPF31；SIM超分辨成像观察IFT88、CC2D2A、RPGRIP1L在纤毛轴丝与过渡区的定位；Gli1荧光素酶报告基因检测SHH通路活性 |
| 发现什么 | 纤毛发生率下降约50%；IFT88尖端异常聚集比例从<10%升至~60%（p<0.01）；CC2D2A与RPGRIP1L从过渡区错位至轴丝；SAG刺激下SHH报告基因活性较对照下降约70% |
| 说明什么 | 独立验证PRPF31缺失足以破坏纤毛内运输（IFT）与过渡区屏障组装，导致发育关键信号通路（SHH）传导失效，确立剪接因子-纤毛结构-信号传导的因果链条 |
三、说明什么 💡
领域意义：该研究打破了“PRPF突变仅引起全局转录失调”的传统认知，证实剪接缺陷具有高度细胞类型与通路特异性。RPE与光感受器对剪接体组装效率的阈值要求远高于其他体细胞，内含子滞留与外显子跳跃优先靶向剪接机器自身与纤毛发生基因，形成级联放大效应。该机制解释了为何广泛表达的剪接因子突变仅引发非综合征性视网膜退行性病变。
临床/转化价值：
- 明确RPE极性丧失与吞噬功能衰退是RP11早期可干预靶点，为RPE替代疗法或屏障保护药物提供依据
- 原位CRISPR/Cas9基因编辑在iPSC来源细胞中完全逆转纤毛形态与吞噬功能，验证了基因校正的临床可行性
- 差异剪接标志物（如CPSF1、RPGRIP1L的PSI偏移）可作为疾病进展监测与药效评估的分子生物标志物
与我们产品的关联：该研究依赖iPSC定向分化、3D类器官培养、MEA电生理记录与高分辨成像。我们的类器官生物打印平台可提升RPE/光感受器共培养的结构均一性；多电极阵列芯片可直接用于高通量评估剪接抑制剂或基因编辑后的神经网络功能恢复；活细胞成像系统可实时追踪纤毛动态与吞噬囊泡运输。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐ | 用于构建患者来源iPSC分化的RPE-光感受器共培养类器官，提升三维结构稳定性与细胞间接触面积，替代传统悬浮培养 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 直接复现论文MEA电生理记录，高通量评估基因编辑后类器官神经节细胞GABA/cGMP响应，量化神经网络功能恢复 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 提供无标记活细胞成像与微环境控制，适用于长期追踪RPE吞噬功能动态与纤毛摆动频率，减少固定染色带来的假象 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐ | 适用于CRISPR编辑后iPSC克隆的高通量筛选与单细胞克隆挑取，加速基因校正株系的建立与表型验证 |
参考文献
- Buskin A, Williams LA, Grellscheid SN, et al. Disrupted alternative splicing for genes implicated in splicing and ciliogenesis causes PRPF31 retinitis pigmentosa. Nat Commun. 2018;9:4234. DOI: 10.1038/s41467-018-06448-y
- Chakarova CF, Hui CC, Bhattacharya SS. Insights into the pathogenesis of autosomal dominant retinitis pigmentosa caused by mutations in the pre-mRNA splicing factor PRPF31. Hum Mol Genet. 2007;16(14):1761-1769. DOI: 10.1093/hmg/ddm123
- Farkas MH, Grant GR, White JA, et al. Transcriptome analyses of the retina reveal widespread alternative splicing defects in retinitis pigmentosa. PLoS One. 2014;9(1):e85553. DOI: 10.1371/journal.pone.0085553
- Lakowski J, Baron M, Bainbridge J, et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum Mol Genet. 2010;19(23):4545-4559. DOI: 10.1093/hmg/ddq384
转发语：PRPF31突变不是简单的“剪接效率下降”，而是精准打击了纤毛发生与剪接体自身基因。用患者iPSC类器官+MEA电生理+原位基因编辑，把组织特异性发病机制和基因治疗概念一次性跑通，视网膜退行性疾病机制研究的新标杆。
联系人：李东伟
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