高密度微电极阵列上定制化体外神经元网络构建方案
Anna-Christina Haeb, Hideaki Yamamoto, Paul Roach, Daniel Merryweather, Yuya Sato, Daniel Tornero, Jordi Soriano | STAR Protocols 2026 | DOI: 10.1016/j.xpro.2026.104349
标签: #高密度微电极阵列 #PDMS微结构 #体外神经元网络 #脑芯片 #电生理记录
一、做什么 🔬
研究背景：基于CMOS的高密度微电极阵列（HD-MEA）具备高时空分辨率的神经元电生理记录能力，但直接在芯片表面集成聚二甲基硅氧烷（PDMS）微结构以控制网络拓扑面临物理与工艺双重障碍。HD-MEA表面存在微米级三维形貌，传统直接贴合易损伤电极涂层；同时芯片成本高昂且需重复使用，现有方案多局限于低密度阵列，缺乏跨平台兼容的标准化流程。
核心问题：
- 能否建立一套适配不同电极拓扑的PDMS微结构制备与HD-MEA精准贴合流程？
- 模块化物理限域如何重塑体外神经元网络的连接模式与动态演化特征？
- 该方案能否在保障电极完整性的前提下实现芯片的多次循环使用？
研究模型：原代大鼠胚胎皮层神经元（E18）培养于3Brain与MaxWell高密度微电极阵列系统。
技术路线：
- 光刻模具制备：利用SU-8光刻胶在硅片上构建10 μm深/400 μm长微通道及限定腔室的反向模板。
- PDMS倒模与灭菌：按10:1质量比混合，60 Torr脱气15 min，70℃固化1 h，打孔后70%乙醇浸泡1 h联合紫外照射30 min。
- 芯片表面修饰：依次使用5% Extran清洗、50 μg/mL PLO涂层干燥、10 μg/mL层粘连蛋白二次涂层。
- 精准对位与接种：将PDMS结构贴合于干燥电极区静置20-24 h，以2,000 cells/mm²密度将细胞悬液滴加至限定腔室。
- 长期记录与复用：DIV 6-21期间进行20 kHz采样记录，实验后使用Extran清洗去除残留物实现芯片循环。
二、发现什么 📊
核心发现1：HD-MEA芯片与PDMS模块化器件的物理集成设计
图1：3Brain芯片64×64电极网格与顶部PDMS结构（4个2 mm直径腔室通过5条平行微通道连接）的装配示意图。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 使用CAD软件设计匹配电极阵列布局的PDMS掩模，光刻制备硅基SU-8反向模具，倒模成型后使用活检打孔器制备腔室。 |
| 发现什么 | PDMS器件包含4个直径2 mm的接种腔室，腔室间通过5条平行微通道（长400 μm、宽10 μm、深10 μm）正交连接，整体厚度控制在0.5-1 mm。 |
| 说明什么 | 物理尺寸与电极网格精确匹配，微通道宽度（10 μm）限制胞体迁移但允许轴突延伸，为后续构建空间隔离的模块化网络奠定结构基础。 |
核心发现2：PDMS微结构的标准化制备与表面清洁流程
图2：从PDMS混合脱气、70℃固化1小时、切割成型到打孔与乙醇/紫外灭菌的完整制备步骤。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将PDMS基胶与固化剂按10:1比例混合，60 Torr真空脱气15 min，70℃烘烤1 h固化，显微镜下切割成型并打孔，随后进行70%乙醇浸泡与紫外灭菌。 |
| 发现什么 | 脱气后气泡完全消除，固化后表面无粘性；70%乙醇处理1 h联合30 min紫外照射可彻底清除未反应有机单体，水洗后无白色沉淀残留。 |
| 说明什么 | 严格的脱气与溶剂清洗流程消除PDMS浸出物对神经元的细胞毒性，保障DIV 6-21期间细胞存活率与电生理信号稳定性。 |
核心发现3：芯片涂层、PDMS贴合与细胞接种的标准化操作流
图3：PLO涂层干燥后放置PDMS，20-24小时固化贴合，随后在腔室内滴加层粘连蛋白并以2,000 cells/mm²密度接种细胞。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在电极区滴加100 μL PLO（50 μg/mL）真空脱气后室温干燥12 h；贴合PDMS静置20-24 h；在腔室内滴加5-10 μL层粘连蛋白（10 μg/mL），真空辅助渗透后接种细胞。 |
| 发现什么 | PLO干燥后形成均匀亲水层，PDMS贴合20-24 h后剥离力显著增强；层粘连蛋白在60 Torr下完全渗入10 μm深微通道；细胞接种1 h后贴壁率达90%以上。 |
| 说明什么 | 分步涂层与真空辅助策略克服PDMS疏水性，确保神经元仅在限定腔室内定向贴壁，避免非特异性生长干扰模块化拓扑。 |
核心发现4：模块化网络与非模块化网络在3Brain系统上的动态差异
图4：模块化网络在DIV 14呈现局部活动聚集，平均相关性曲线在DIV 7-21期间维持在0.20±0.05，而非模块化网络相关性从0.15升至0.45。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在3Brain HD-MEA上同步培养非模块化（均质）与模块化（PDMS限域）网络，DIV 7-21期间每日进行5-20 min记录，采样率20 kHz，计算电极间平均相关性与有效连接图。 |
| 发现什么 | 非模块化网络DIV 7-21平均相关性从0.15线性升至0.45，呈现全芯片同步爆发；模块化网络相关性稳定在0.20±0.05，DIV 14栅格图显示独立模块爆发与跨模块协同事件交替出现。 |
| 说明什么 | 物理限域强制网络形成“隔离-整合”双态动力学，打破传统均质培养的高度同步化瓶颈，更贴近真实脑区局部微环路的异步活动特征。 |
核心发现5：方案在MaxWell系统上的跨平台适配与微尺度网络记录
图5：200 μm边长微腔室网络在DIV 14记录到活动传播延迟为3-25 ms，本底噪声仅2.3 μV rms，证明方案兼容不同电极拓扑。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将PDMS微结构尺寸缩小至200 μm边长微腔室，移植至MaxWell MaxOne HD-MEA系统，采用相同涂层与接种流程，记录DIV 14自发活动并分析传播时序。 |
| 发现什么 | 微尺度网络在DIV 14展现复杂自发活动，全局同步爆发期间跨模块信号传播延迟分布在3-25 ms区间；系统本底噪声为2.3 μV rms，信噪比满足毫秒级事件解析。 |
| 说明什么 | 协议成功适配凸起电极拓扑，在微尺度下仍保留突触传递的毫秒级时间精度，验证了该流程在不同厂商HD-MEA平台间的通用性。 |
核心发现6：不同厂商HD-MEA电极表面形貌的扫描电镜对比
图6：3Brain芯片电极呈平坦嵌入式结构（高度差<2 μm），MaxWell芯片电极呈凸起三维形貌（高度差~15 μm），PDMS贴合后均无电极刮擦或断裂。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 使用扫描电子显微镜（SEM）对3Brain与MaxWell芯片的裸电极表面进行形貌表征，并在PDMS贴合实验后二次成像评估电极完整性。 |
| 发现什么 | 3Brain电极为平面嵌入式，表面起伏<2 μm；MaxWell电极为凸起式，高度差约15 μm；PDMS贴合并剥离后，两种芯片电极涂层均无物理刮痕或断裂，表面粗糙度变化<5%。 |
| 说明什么 | 柔性PDMS自适应不同表面形貌，结合Extran清洗流程可实现电极无损剥离，为高价值HD-MEA芯片的重复使用提供工艺保障。 |
三、说明什么 💡
领域意义：该方案将PDMS微流控限域技术与CMOS高密度电生理记录深度融合，填补了“脑芯片”架构标准化构建的空白。传统体外培养依赖随机连接，导致网络动力学高度同质化；本研究证实物理微结构可强制网络形成稳定的“隔离-整合”双态模式，使体外模型在拓扑复杂度与动态多样性上向真实脑组织靠拢。争议点在于微通道尺寸（10 μm vs 200 μm）对轴突生长速率与突触可塑性的长期影响仍需纵向验证。
临床/转化价值：
- 为神经退行性疾病（如阿尔茨海默症、帕金森病）提供高保真体外微环路模型，支持药物对特定模块间连接强度的靶向筛选。
- 标准化清洗与复用流程将单次实验芯片成本降低约60%，推动HD-MEA在高通量神经毒理学评估中的商业化应用。
- 毫秒级跨模块传播记录能力为脑机接口（BCI）的闭环解码算法提供高质量训练数据集。
与我们产品的关联：
- 3Brain CorePlate HD-MEA：论文直接使用该平台进行DIV 6-21长期记录，其20 kHz采样率与低本底噪声（11 μV rms）是解析模块化网络动态的核心硬件。
- Celvivo：提供DIV 6-21期间的恒温恒湿培养与实时明场/荧光成像监测，可无缝衔接HD-MEA电生理数据，实现“形态-电活动”多模态关联分析。
- SIEVEWELL：其微流控腔室设计与论文PDMS模块化限域理念高度一致，适用于高通量分区培养与平行药物处理，可替代手工PDMS贴合提升通量。
- Cellink BIO X：可用于高精度生物墨水打印替代传统光刻倒模，实现PDMS微结构的快速迭代与自动化细胞接种，降低工艺门槛。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| 3Brain CorePlate HD-MEA | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 论文核心记录平台，直接用于DIV 6-21模块化网络电生理采集，20 kHz采样率与低噪声保障毫秒级事件解析。 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 提供DIV 6-21长期培养期间的恒温恒湿环境与实时成像，可与HD-MEA数据同步，追踪神经元形态成熟与网络演化。 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐⭐ | 微流控腔室架构与论文PDMS限域逻辑一致，适用于高通量模块化培养与平行给药，替代手工贴合提升实验通量。 |
| Cellink BIO X | ⭐⭐ | 可用于生物墨水打印定制化微结构，或实现自动化细胞精准接种，降低光刻倒模与手工打孔的工艺复杂度。 |
参考文献
- Haeb AC, Yamamoto H, Roach P, Merryweather D, Sato Y, Tornero D, Soriano J. Protocol for tailored in vitro neuronal networks on high-density microelectrode arrays with polydimethylsiloxane microstructures. STAR Protocols. 2026. DOI: 10.1016/j.xpro.2026.104349
- Sato Y, et al. High-density microelectrode array recordings of modular neuronal networks. Nature Protocols. 2024. DOI: 10.1038/s41596-024-00987-1
- Wolff A, et al. Data analysis pipelines for high-density microelectrode array recordings. Journal of Neural Engineering. 2025. DOI: 10.1088/1741-2552/ad8f3c
- Murota K, et al. Microfabrication of sub-millimeter PDMS devices for neuronal patterning. Lab on a Chip. 2023. DOI: 10.1039/d3lc00451a
转发语：这篇Protocol把HD-MEA和PDMS微结构贴合的坑全填平了，DIV 6-21的模块化网络记录数据非常漂亮，做脑芯片和神经毒理筛选的同事可以直接抄作业。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：STAR Protocols 2026 Protocol for tailored in vitro neuronal networks