人基底核Meynert类器官的构建及其胆碱能投射环路在移植嵌合体中的功能验证
Da Wang, Xinyue Zhang, Xiao-Yan Tang, Yixia Gan, Hanwen Yu, Shanshan Wu, Yuan Hong, Mengdan Tao, Chu Chu, Xiaoxuan Qi, Hao Hu, Yimin Zhu, Wanying Zhu, Xiao Han, Min Xu, Yi Dong, Qing Cheng, Xing Guo, Yan Liu | Cell Stem Cell 2025 | 10.1016/j.stem.2025.10.004
标签: #脑类器官 #胆碱能神经元 #神经环路重建 #唐氏综合征模型 #高密度微电极阵列
一、做什么 🔬
研究背景：基底核Meynert（nbM）是前脑主要的胆碱能输出核团，通过长程轴突广泛支配大脑皮层，调控认知与记忆功能。阿尔茨海默病与唐氏综合征（DS）均伴随nbM-皮层胆碱能通路退化，导致严重认知障碍。传统二维培养无法重现胆碱能神经元的空间排布、长距离轴突导向及跨脑区突触连接，限制了对胆碱能环路发育与病理机制的解析。
核心问题：
- 能否利用人多能干细胞定向分化出具备区域特异性的基底核Meynert类器官？
- 体外构建的nbM-皮层嵌合体能否形成功能性长程胆碱能投射与突触连接？
- 该嵌合体模型能否精准重现唐氏综合征患者的胆碱能投射缺陷与网络同步异常？
研究模型：人多能干细胞（hPSCs）来源的基底核类器官（hnbMOs）与皮层类器官（hCOs）融合体系，结合免疫缺陷小鼠双移植与人胎脑切片共培养模型。
技术路线：
- 定向分化诱导：SHH/Pur/NGF时序调控，驱动神经上皮向MGE祖细胞及胆碱能神经元分化
- 单细胞转录组与空间映射：scRNA-seq结合VoxHunt算法，比对小鼠Allen脑图谱与人胎脑空间转录组
- 多模态电生理记录：全细胞膜片钳、GCaMP6s钙成像与HD-MEA评估网络同步性与信号流向
- 病毒示踪与光遗传学：狂犬病毒逆行标记与ChR2光刺激，验证跨类器官突触连接
- 活体双移植与疾病建模：空间分离移植重建人源化通路，利用DS iPSCs评估轴突发育缺陷
二、发现什么 📊
核心发现1：优化SHH浓度可高效诱导具备基底核Meynert区域特异性的类器官
图1：750 ng/mL SHH处理使NKX2.1阳性率达92.72%±0.766%，CHAT+神经元占比达38.13%±1.62%。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 设置SHH浓度梯度（0-750 ng/mL）处理day10神经上皮，联合Pur与NGF诱导分化；day36/63进行scRNA-seq聚类，利用VoxHunt将转录组映射至小鼠E13脑图谱与人胎脑8-21周空间数据 |
| 发现什么 | 750 ng/mL组NKX2.1表达最高（92.72%±0.766%），day63时CHN与GABA细胞比例从25.4%升至49.6%；转录组与小鼠MGE及人胎脑21周nbM区域相关性最高，NKX6-1/GBX2/ZIC4等异源标志物几乎不表达 |
| 说明什么 | 高浓度SHH联合时序因子可精准模拟体内MGE发育轨迹，排除脊髓运动神经元或内侧隔核身份，确立类器官的基底核特异性，为后续环路构建提供标准化细胞来源 |
核心发现2：类器官内胆碱能神经元具备典型投射形态与网络同步放电功能
图2：90% mCherry+细胞共表达CHAT，KCl刺激使ACh3.0荧光强度显著上升（ΔF/F峰值>150%），HD-MEA记录到13个类器官的同步放电事件。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 构建CHAT-tdTomato报告系，day100进行形态学观察；day63全细胞膜片钳记录离子流与动作电位；利用ACh3.0生物传感器进行KCl刺激活细胞成像；day80/120分别进行GCaMP6s钙成像与HD-MEA记录 |
| 发现什么 | 90% mCherry+细胞为CHAT+，神经元具长轴突与树突棘；膜片钳记录到典型钠钾电流与自发AP；KCl刺激诱发ACh3.0荧光强度显著上升；HD-MEA检测到13个类器官的平均放电率及网络级同步事件 |
| 说明什么 | 类器官不仅完成胆碱能谱系分化，更在三维微环境中形成功能性突触网络，具备长程投射所需的电生理基础与递质释放能力，满足体外环路功能验证的硬件条件 |
核心发现3：移植至小鼠基底核的类器官可重建长达3.5毫米的人源化胆碱能投射束
图3：移植6个月后，STEM121+人源纤维在S1、M1及BLA区域广泛分布，投射长度达3.5毫米。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将day37 hnbMOs移植至SCID小鼠nbM区域；2/6个月进行T2-MRI定位与3D重建；免疫荧光追踪STEM121/hSYN/VACHT表达；与GW15人胎脑切片共培养2周观察轴突延伸 |
| 发现什么 | 移植体准确定位于宿主nbM，6个月时形成3.5 mm长投射束；S1/M1/BLA区荧光覆盖率较CPu/HPC高3.2倍（p<0.001）；共培养2周后GFP+纤维跨越>2 cm进入胎脑皮层，紧密贴附宿主锥体神经元并表达人源SYP |
| 说明什么 | 体内微环境提供必要的机械支撑与导向信号，突破体外培养限制；证实hnbMOs具备重建长程特异性投射的内在能力，为活体环路功能整合奠定解剖学基础 |
核心发现4：体外nbM-皮层嵌合体形成定向胆碱能突触连接并受毒蕈碱受体调控
图4：融合20天后GFP+投射面积占比从6.06%升至22.51%（p<0.001），光遗传刺激诱发约40 pA的EPSC。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | hnbMOs与hCOs融合，AAV-GFP标记投射；狂犬病毒逆行示踪；光遗传学记录EPSC；scopolamine阻断实验；HD-MEA功能连接分析；ACh3.0监测动态释放 |
| 发现什么 | 投射面积占比随时间升至22.51%，避开hCO室管膜区；60%逆行标记细胞为CHAT+；光刺激诱发~40 pA EPSC；scopolamine处理使hCO钙活动频率下降78%（p<0.001）；HD-MEA显示hnbMO侧为信号发送端（p<0.01） |
| 说明什么 | 嵌合体成功模拟体内nbM-皮层单向投射拓扑结构，胆碱能输入主要通过毒蕈碱受体调控皮层网络兴奋性；确立体外跨脑区功能连接，验证了类器官融合策略的生理相关性 |
核心发现5：活体双移植策略在宿主脑内完整重构人源nbM-皮层胆碱能通路
图5：双移植4个月后，光刺激hnbMOs可在mCherry+皮层神经元中记录到约20 pA的oEPSC。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | hCOs移植至小鼠皮层，hnbMOs移植至小鼠nbM；6个月组织学分析投射分布；4个月脑片光遗传膜片钳记录跨类器官突触电流 |
| 发现什么 | 移植体存活良好，hnbMOs衍生纤维广泛侵入hCOs，hCOs纤维向宿主深部核团延伸；光刺激hnbMOs在hCO神经元中诱发~20 pA oEPSC（n=20细胞，6只小鼠）；STEM121+纤维在hCO内覆盖率>15% |
| 说明什么 | 空间分离的双移植模型克服了单一嵌合体尺寸限制，在活体水平验证了人源胆碱能通路的跨脑区功能整合；证明移植类器官可与宿主及异体移植物建立双向解剖与电生理连接 |
核心发现6：唐氏综合征来源嵌合体重现胆碱能投射缺陷与轴突发育通路下调
图6：DS组NKX2.1（79.42%±1.569%）与CHAT（25.83%±1.35%）显著低于对照（p<0.001），逆行双阳性细胞比例下降至对照的35%。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | DS iPSCs分化hnbMOs，与对照构建嵌合体；scRNA-seq分析差异基因与GO通路；狂犬病毒示踪；钙成像与切片共培养对比；移植后测量轴突长度 |
| 发现什么 | DS组NKX2.1与CHAT阳性率显著低于对照（p<0.001）；逆行双阳性细胞比例下降至对照的35%（p<0.001）；m-AChR覆盖率降低42%（p<0.001）；钙同步活动减少；GO分析显示轴突发生通路显著富集下调；共培养与移植均证实投射缺陷源于nbMOs自身 |
| 说明什么 | DS病理表型直接源于基底核祖细胞向胆碱能神经元分化受阻及轴突延伸能力缺陷；该模型精准捕获了神经发育障碍的环路级联损伤机制，为靶向轴突发育基因（如ANK3/NCAM2）的干预提供可量化平台 |
三、说明什么 💡
领域意义：该研究将脑类器官技术从“单一区域分化”推进至“跨脑区长程环路重建”阶段。过去学界依赖二维培养或单一类器官，难以解析胆碱能神经元的轴突导向与突触整合机制。本研究通过活体双移植与光遗传学记录，证实人源类器官具备重建复杂投射网络的能力，确立了类器官嵌合体作为研究皮层下-皮层环路的金标准模型。争议点在于体外微环境能否完全替代体内神经营养因子梯度，该研究通过体内移植验证了类器官的内在发育程序足以驱动长距离投射。
临床/转化价值：
- 为阿尔茨海默病、唐氏综合征等胆碱能退行性疾病提供高通量药物筛选与毒性评估平台
- 验证干细胞移植修复胆碱能通路的解剖学可行性，明确最佳移植靶区与时间窗口
- 揭示轴突发育关键靶点（如ANK3、NCAM2）的干预潜力，推动靶向促轴突再生药物的开发
与我们产品的关联：
- HD-MEA记录网络同步性与信号流向是验证嵌合体功能连接的核心环节，3Brain系统可直接复现该实验流程
- 类器官长期培养与动态成像依赖稳定的三维微环境控制，Celvivo系统可优化营养梯度与代谢废物清除
- 高通量药物筛选需标准化类阵列培养，SIEVEWELL微孔板可提升DS模型化合物测试的通量与一致性
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐ | 用于标准化hnbMOs/hCOs融合与高通量嵌合体构建，精确控制类器官空间排布与融合界面，提升批次一致性 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 论文实际使用HD-MEA记录网络同步与功能连接，可直接用于检测胆碱能输入对皮层类器官的EPSC诱发与信号流向分析 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐⭐ | 潜在用于类器官长期动态培养的微环境控制，维持三维培养中的氧分压与代谢稳态，延长嵌合体存活周期 |
参考文献
- Wang D, Zhang X, Tang XY, et al. Generation of human nucleus basalis organoids with functional nbM-cortical cholinergic projections in transplanted assembloids. Cell Stem Cell. 2025. 10.1016/j.stem.2025.10.004
- Qian X, Nguyen HN, Song MM, et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 2016. 10.1016/j.cell.2016.04.017
- Trujillo CA, Gao R, Negraes PD, et al. Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development. Cell Stem Cell. 2019. 10.1016/j.stem.2019.08.002
- Birey F, Andersen J, Makinson CD, et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature. 2017. 10.1038/nature22330
- Lancaster MA, Knoblich JA. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2014. 10.1038/nprot.2014.147
转发语：这篇Cell Stem Cell首次用类器官拼出了人脑基底核到皮层的完整胆碱能通路，连唐氏综合征的投射缺陷都能精准复现，做神经退行性疾病和环路重建的同行可以直接抄作业了。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：Cell Stem Cell 2025 人基底核Meynert类器官构建