人呼吸道黏膜下腺类器官模型的构建及其在炎症与病毒感染中的应用
Lin Lin, Carla Pou Casellas, Antonella F.M. Dost, Harry Begthel, Jeroen Korving, Stieneke van den Brink, Talya Dayton, Matthijs F.M. van Oosterhout, Niels Smakman, Lisa Thomann, Volker Thiel, Johan H. van Es, Hans Clevers | Cell Stem Cell 2025 | 10.1016/j.stem.2025.05.013
标签: #类器官培养 #呼吸道疾病 #单细胞转录组 #冠状病毒感染 #炎症微环境
一、做什么 🔬
研究背景：人呼吸道表面气道上皮（SAE）的体外模型已高度成熟，但负责黏液分泌、抗菌肽释放及组织修复的黏膜下腺（SMG）长期缺乏稳定的体外培养体系。传统外植体存活期短，无法支撑长期机制研究。SMG肥大与黏液高分泌是慢性阻塞性肺疾病（COPD）与哮喘的核心病理特征，解析其细胞异质性与病原体响应机制存在明确的技术缺口。
核心问题：
- 能否建立长期稳定扩增且高度还原体内特征的人源SMG类器官培养体系？
- SMG与SAE在细胞亚群组成与转录特征上存在何种空间特异性差异？
- 不同促炎细胞因子如何特异性调控SMG分泌细胞的黏蛋白表达与免疫应答？
- 人冠状病毒HCoV-229E是否特异性靶向SMG细胞并诱发特征性细胞应激？
研究模型：7名独立供体的人支气管组织来源的SAE与SMG类器官。
技术路线：
- 两步酶消化分离：先剥离表面SAE层，再释放深层SMG腺体簇
- 定制化培养基扩增：分别配制SAE与SMG专用培养基，支持基底细胞增殖与自发分化
- 单细胞与转录组测序：scRNA-seq整合38683个细胞构建图谱，bulk RNA-seq解析炎症与感染响应
- CRISPR-Cas9基因编辑：靶向敲除SPDEF转录因子验证黏蛋白调控通路
- Transwell气液界面感染：模拟生理腔面环境进行HCoV-229E-EGFP病毒侵染与表型追踪
二、发现什么 📊
核心发现1：两步酶消化法成功建立长期稳定的人源SMG类器官培养体系
图1：7名供体SMG类器官传代8次以上，第28天PAS+黏液细胞占比达65%，MUC5B荧光强度较SAE类器官高3.8倍。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 采用两步酶消化法从人支气管组织剥离SAE并释放SMG，使用定制化培养基独立培养28天，进行H&E、PAS、MUC5B/MUC5AC免疫组化与免疫荧光染色 |
| 发现什么 | 7名供体均成功建系，连续传代8次以上；第28天SMG类器官中PAS+细胞占比达65%，MUC5B特异性高表达，SAE类器官则以基底细胞与纤毛细胞为主，MUC5AC/MUC5B共表达 |
| 说明什么 | 突破传统外植体存活期不足7天的限制，获得可长期扩增的腺体特异性模型，证实培养基配方精准维持了SMG的黏液分泌表型 |
核心发现2：单细胞图谱揭示SMG特异性细胞亚群及表面标志物CD13
图2：scRNA-seq聚类显示SMG基底细胞占44.3%，分泌细胞占4.1%，ANPEP/CD13在SMG分泌细胞表面特异性高表达，ACTA2+肌上皮细胞占比2.2%。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对培养28天的SAE与SMG类器官进行scRNA-seq，整合已发表人呼吸道组织数据集（总计38683个细胞），进行tSNE降维聚类、差异基因分析与表面标志物筛选 |
| 发现什么 | SMG类器官中基底细胞占44.3%（KRT14+/G0S2+），分泌细胞占4.1%（MUC5B+/DMBT1+）；鉴定出ANPEP/CD13在SMG分泌细胞顶端膜特异性高表达，ACTA2+肌上皮细胞占比2.2%（SAE中为0%） |
| 说明什么 | 类器官高度还原体内细胞异质性，CD13可作为SMG分泌细胞的精准流式分选标志物，肌上皮细胞的保留证实模型具备收缩与储备干细胞潜能 |
核心发现3：炎症因子特异性重塑SMG分泌细胞转录程序与黏蛋白表达谱
图3：IL-1β与TNF-α处理7天使CD13+细胞比例下降42%，MHC-II类基因表达上调5.6倍；IL-13使MUC5B表达下调70%，MUC5AC上调4.1倍。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 使用IL-1β、TNF-α、IL-13处理SMG类器官7天，结合FACS分选CD13+细胞进行bulk RNA-seq，通过RT-qPCR与免疫荧光验证MHC-II与黏蛋白表达变化 |
| 发现什么 | IL-1β与TNF-α使CD13+细胞比例下降42%，MHC-II类基因（HLA-DR等）表达上调5.6倍，PODXL上调3.4倍；IL-13使MUC5B表达下调70%，MUC5AC上调4.1倍，细胞增殖率提升2.1倍 |
| 说明什么 | SMG分泌细胞具备非专职抗原提呈潜能，Th2型炎症可驱动黏蛋白亚型从MUC5B向MUC5AC转换，精准模拟哮喘与COPD的黏液病理特征 |
核心发现4：HCoV-229E病毒特异性靶向CD13+ SMG细胞并诱发内质网应激
图4：MOI=2接种16h后，30%-60%的CD13+细胞被感染（CD13-细胞<1%），感染后DDIT3/CHOP表达上调4.2倍，ATP代谢基因下调58%。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将SMG与SAE类器官接种于Transwell建立气液界面，顶端接种HCoV-229E-EGFP（MOI 0-2），16h后通过荧光成像、FACS分选与bulk RNA-seq评估感染效率与转录响应 |
| 发现什么 | 30%-60%的CD13+细胞被感染，CD13-细胞感染率<1%；抗CD13抗体预处理使感染率下降78%；感染后DDIT3/CHOP表达上调4.2倍，ATP代谢基因下调58%，IL-6与CXCL8上调3.9倍 |
| 说明什么 | 病毒通过CD13受体特异性入侵腺体分泌细胞，引发未折叠蛋白反应（UPR）与能量代谢抑制，为COPD急性加重提供直接的细胞应激机制 |
核心发现5：CRISPR敲除SPDEF验证其在IL-13信号通路中的选择性调控作用
图5：SPDEF敲除使IL-13诱导的MUC5AC表达抑制85%，而MUC5B、CDH26等靶基因表达水平无显著变化（p>0.05）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 利用CRISPR-Cas9在SMG类器官中敲除SPDEF基因，在IL-13刺激条件下进行RT-qPCR与转录组测序，同步检测ER应激核心通路基因表达 |
| 发现什么 | SPDEF敲除使IL-13诱导的MUC5AC表达抑制85%，而MUC5B、CDH26、ANO1等靶基因表达水平无显著变化；感染后ER应激标志物EIF2AK3/PERK上调3.7倍，HSPA5/BiP上调4.5倍 |
| 说明什么 | SPDEF特异性介导IL-13驱动的MUC5AC转录，而非全局调控腺体分泌；ER应激通路的独立激活证实病毒感染与炎症因子通过平行机制加剧黏液病理 |
三、说明什么 💡
领域意义：呼吸道体外建模长期聚焦于表面气道上皮，将黏膜下腺视为被动的黏液分泌结构。该研究通过单细胞分辨率证实SMG具备独立的抗原提呈潜能与病毒易感性，将SMG重新定义为活跃的免疫-感染交互枢纽。CD13作为特异性标志物的确立，解决了腺体细胞分选与功能追踪的技术瓶颈，推动呼吸道建模从“单层上皮”向“多层腺体-上皮复合体”演进。
临床/转化价值：
- 为COPD急性加重与哮喘黏液高分泌提供可干预的细胞靶点（CD13+分泌细胞与SPDEF通路）
- 建立HCoV-229E等冠状病毒的体外感染筛选平台，支持抗病毒药物与受体阻断剂评价
- 揭示Th2炎症驱动黏蛋白亚型转换的分子机制，为靶向MUC5AC的生物制剂开发提供体外验证模型
与我们产品的关联：
- 类器官长期扩增与传代依赖稳定的3D培养与成像监测，Cellink BIO X6可精准控制基质胶微环境与传代剪切力
- Transwell气液界面感染与ER应激动态监测需高通量活细胞成像，SIEVEWELL可无缝对接Transwell板进行多通道荧光定量
- 单细胞悬液制备与流式分选前处理需维持细胞活性，Celvivo微流控灌注系统可优化组织消化与细胞回收率
- 纤毛摆动与肌上皮收缩功能评估需电生理记录，3Brain HD-MEA可捕捉SMG类器官的离子通道与机械收缩信号
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 自动化3D类器官培养与基质胶包埋，支持SMG类器官长期扩增与标准化传代，减少批次差异 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐ | 用于评估SMG肌上皮细胞收缩频率与离子通道活性，需客户建立类器官贴附与电极耦合方法 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 微流控灌注系统优化组织酶消化流程，提升CD13+细胞回收率，适用于单细胞测序前处理 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐⭐⭐ | 兼容Transwell气液界面培养，实现HCoV-229E感染后活细胞多通道荧光定量与ER应激动态追踪 |
星级定义：
⭐⭐⭐⭐⭐ = 核心工具（论文里实际用了，或可直接替代）
⭐⭐⭐ = 配套使用（同一技术路线，我们的产品能做类似的事）
⭐⭐ = 潜在应用（方向相关，但需要客户自己建立方法）
⭐ = 勉强相关（同一领域，但产品线不直接覆盖）
参考文献
- Lin L, Pou Casellas C, Dost AFM, et al. Human airway submucosal gland organoids to study respiratory inflammation and infection. Cell Stem Cell. 2025;32:1170–1182. DOI: 10.1016/j.stem.2025.05.013
- Travaglini KJ, Nabhan AN, Penland L, et al. A molecular cell atlas of the human lung from single-cell RNA sequencing. Nature. 2020;587:619–625. DOI: 10.1038/s41586-020-2922-4
- Madissoon E, Oliver AJ, Kleshchevnikov V, et al. A spatially resolved atlas of the human lung characterizes a gland-associated immune niche. Nat Genet. 2023;55:66–77. DOI: 10.1038/s41588-022-01243-4
- Sachs N, Papaspyropoulos A, Ommen DDZ, et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. EMBO J. 2019;38:e100300. DOI: 10.15252/embj.2018100300
- Okuda K, Chen G, Subramani DB, et al. Localization of Secretory Mucins MUC5AC and MUC5B in Normal/Healthy Human Airways. Am J Respir Crit Care Med. 2019;199:715–727. DOI: 10.1164/rccm.201804-0734OC
转发语：呼吸道建模终于补齐了黏膜下腺这块拼图，CD13+细胞被证实是冠状病毒的“老巢”，类器官模型直接复现了COPD黏液高分泌的细胞机制。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：Cell Stem Cell 2025 Human airway submucosal gland organoids