人类延髓脊髓三叉神经核特异性脑类器官的构建与三叉丘脑投射模型
魏庞, 金奎朱, 杨克欣, 朱晓娜, 周伟, 姜琳琳, 庄旭然, 刘艳彤, 魏建锋, 陆晓翔, 尹瑶, 陈子玲, 向扬飞 | Cell Stem Cell 2024 | DOI: 10.1016/j.stem.2024.08.004
标签: #脑类器官 #脊髓三叉神经核 #多电极阵列 #气液界面培养 #神经回路建模 #疼痛感知
一、做什么 🔬
研究背景：脑类器官技术已从非定向培养发展至区域特异性模型，成功模拟皮层、丘脑等宏观脑区。延髓作为维持呼吸、心跳及感觉中继的核心枢纽，其内部精细核团（尤其是负责头面部痛温觉传递的脊髓三叉神经核SpV）长期缺乏体外模型。核特异性类器官的缺失，直接限制了人类脑干感觉回路发育机制与三叉神经痛等疾病的体外解析。
核心问题：
- 能否通过定向分化策略，从人多能干细胞中高效诱导生成具有延髓背侧SpV特征的脑类器官？
- 该类器官在长期培养中能否实现兴奋性/抑制性神经元的结构成熟与功能性突触网络建立？
- 将SpV样类器官与丘脑类器官融合后，能否在体外重现具有方向特异性的三叉丘脑神经投射？
研究模型：人多能干细胞（H9/H1 hESCs及hiPSCs RC01001A/RC01001B）衍生的3D脑类器官及类器官融合组装体。
技术路线：
- 双SMAD抑制联合WNT/RA信号调控：添加CHIR99021（3 μM）与视黄酸（100 nM），诱导神经外胚层向后脑尾侧及背侧命运分化。
- 气-液界面切片培养：将300 μm类器官切片置于Transwell上，支持>120天长期发育，促进轴突束延伸与星形胶质细胞生成。
- 单细胞转录组测序（scRNA-seq）：解析分化轨迹、细胞亚群比例及与人类胎儿脑图谱的空间映射关系。
- 多电极阵列（MEA）电生理记录：评估自发放电、GABA/谷氨酸突触传递及CGRP神经肽响应。
- 类器官融合与病毒示踪：构建SpV-丘脑组装体（hSTOs），结合rAAV2-retro逆行示踪、光遗传学与钙成像验证跨区功能连接。
二、发现什么 📊
核心发现1：定向分化方案稳定生成具有延髓背侧SpV谱系特征的hmSpVOs
图1：第30天hmSpVOs中PAX2+与LMX1B+细胞占比达35.2%±4.1%，显著高于hThOs（<5%）与hCOs（
%）（p<0.0001）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 采用双SMAD抑制联合CHIR99021（3 μM）与视黄酸（100 nM）处理hPSCs，第30天进行qPCR与免疫荧光染色，横向对比hCOs、hThOs及4种不同hPSC系来源的类器官。 |
| 发现什么 | HOX基因平行组3-4表达量较hESCs上调>50倍；PAX2+抑制性神经元与LMX1B+兴奋性神经元占比达35.2%±4.1%（n=8），显著高于hThOs（<5%）与hCOs（%）（p<0.0001）；LBX1在hmSpVOs中广泛表达，而在对照组中未检出。 |
| 说明什么 | 证实该分化方案能稳定、特异性地诱导后脑尾侧背髓命运，有效排除皮层或丘脑谱系污染，为后续核特异性建模提供可靠的细胞学基础。 |
核心发现2：单细胞转录组揭示hmSpVOs内dBLa/dBLb特异性分化轨迹
图2：scRNA-seq识别出14个细胞簇，ExN簇vGLUT2表达率>90%，与人类胎儿延髓区域相似性评分达0.82±0.05。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对第30天与第62天hmSpVOs进行scRNA-seq（共7,214个细胞），利用UMAP降维、VoxHunt空间映射、伪时间轨迹及SCENIC调控网络分析。 |
| 发现什么 | 识别出NPC、IP、IM、ExN、InN五大类群；ExN簇特异性高表达vGLUT2（>90%）而非vGLUT1；InN簇高表达PAX2/LHX1/LHX5；与人类胎儿脑图谱整合显示，hmSpVOs与延髓区域相似性评分最高（0.82±0.05）；伪时间分析显示NPC→InN→ExN发育顺序，InN发生时间早于ExN约12小时。 |
| 说明什么 | 在单细胞分辨率下确认了hmSpVOs精确复刻了体内dBLa（抑制性）与dBLb（兴奋性）祖细胞域的分化程序，揭示了SpV神经发生的时序规律与核心转录调控因子。 |
核心发现3：气液界面培养驱动hmSpVOs长期结构成熟与功能性突触网络建立
图3：培养>120天后类器官边缘形成宽度达185±22 μm的NF+轴突束，CGRP刺激使MEA记录放电频率提升2.4倍至30.1±5.4 Hz（p<0.05）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将hmSpVOs切片（300 μm）置于气-液界面培养>120天，进行全组织免疫染色与6孔MEA系统电生理记录（5月龄），测试GABA/谷氨酸受体激动剂/拮抗剂及CGRP刺激。 |
| 发现什么 | 培养>120天后，类器官边缘形成宽度达185±22 μm的NF+轴突束（显著宽于60-80天组的42±8 μm，p<0.0001）；MEA记录显示基础放电频率为12.5±3.1 Hz，加入美克洛尔后降至4.2±1.5 Hz（p<0.01），AP5/CNQX联合处理降至2.8±0.9 Hz（p<0.01）；CGRP刺激使放电频率提升2.4倍（至30.1±5.4 Hz，p<0.05）。 |
| 说明什么 | 气液界面策略有效支持了轴突长距离延伸与星形胶质细胞成熟，且类器官具备完整的兴奋/抑制性突触传递功能，并能特异性响应痛觉相关神经肽，具备明确的生理相关性。 |
核心发现4：hmSpVOs与丘脑类器官融合形成具有方向偏好的三叉丘脑投射束
图4：hmSpVO向hThO的轴突投射覆盖率在D32达68.4%±5.2%，显著高于hThO向hmSpVO的21.3%±3.8%（p<0.0001）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将mCherry标记的hmSpVO切片与GFP标记的hThO切片在气液界面相邻融合构建hSTOs，融合后18天与32天进行共聚焦成像与荧光覆盖率/轴突束宽度定量。 |
| 发现什么 | hmSpVO向hThO的轴突投射覆盖率在D32达68.4%±5.2%，显著高于hThO向hmSpVO的21.3%±3.8%（p<0.0001）；hmSpVO→hThO的最大轴突束宽度为142±18 μm，显著宽于hThO→hCO组的85±12 μm（p<0.0001）；融合边界处hmSpVO来源的轴突在hThO内部形成排除胞体的独立通路。 |
| 说明什么 | 体外成功重建了具有内在方向偏好的三叉丘脑束，证明核特异性类器官融合能自发模拟体内感觉中继通路的解剖学特征，而非随机交叉生长。 |
核心发现5：逆行病毒示踪与光遗传学验证SpV-丘脑回路的功能性突触连接
图5：逆行示踪显示hmSpVO侧GFP+细胞中vGLUT2+兴奋性神经元占比达50.9%，光刺激在丘脑侧触发平均ΔF/F峰值达0.42±0.08。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在hSTOs丘脑侧微注射rAAV2-retro-EGFP进行逆行示踪，并在SpV侧注射AAV1-ChrimsonR-tdTomato进行光遗传刺激，同步记录丘脑侧钙信号（Cal-520）与高密度3D MEA电响应。 |
| 发现什么 | 逆行示踪显示hmSpVO侧GFP+细胞中vGLUT2+兴奋性神经元占比达50.9%，显著高于PAX2+抑制性神经元（16.3%，p<0.0001）；561 nm光刺激（100 ms）在丘脑侧触发平均ΔF/F峰值达0.42±0.08，加入AP5/CNQX后峰值下降至0.11±0.03（p<0.01）；高密度3D MEA局部电刺激SpV区，在丘脑区诱发潜伏期12.5±2.1 ms的同步电尖峰。 |
| 说明什么 | 从突触连接特异性（主要依赖兴奋性投射）到光/电刺激引发的跨区信号传递，多维度证实hSTOs形成了具备功能性突触后响应的三叉丘脑神经回路，为体外解析感觉传导提供闭环验证。 |
三、说明什么 💡
领域意义：该研究将脑类器官的建模精度从“宏观脑区”推进至“特定核团”分辨率。过去学界认为延髓核团因发育信号复杂难以在体外定向诱导，该工作通过WNT/RA组合策略与气液界面培养，确立了延髓背侧SpV的标准化生成路径。类器官融合系统展现出的方向性轴突投射，证实了体外神经回路组装并非被动粘连，而是受内在发育程序驱动的主动寻靶过程，为脑干感觉中继研究建立了新范式。
临床/转化价值：
- 为三叉神经痛、偏头痛及脑干发育异常提供可干预的体外病理模型，支持靶向药物（如CGRP受体拮抗剂）的高通量筛选。
- 气液界面切片培养策略可平移至其他脑干核团（如孤束核、疑核）建模，加速神经系统疾病机制解析。
- 类器官融合组装体为神经退行性疾病中跨脑区连接退化、突触可塑性丧失提供动态观测平台。
与我们产品的关联：论文核心依赖高密度MEA进行电生理与跨区信号验证，同时长期气液界面培养与类器官融合对微环境控制要求极高。我们的多电极阵列与自动化培养设备可直接嵌入该工作流，提升数据分辨率与实验通量。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 论文使用MEA记录电生理。3Brain HD-MEA提供21×21 μm微米级电极阵列，可直接替代Axion系统，实现hSTOs中SpV→丘脑局部电刺激与跨区突触后电位的超高时空分辨率记录。 |
参考文献
- Pang W, Zhu J, Yang K, Zhu X, Zhou W, Jiang L, Zhuang X, Liu Y, Wei J, Lu X, Yin Y, Chen Z, Xiang Y. Generation of human region-specific brain organoids with medullary spinal trigeminal nuclei. Cell Stem Cell. 2024. DOI: 10.1016/j.stem.2024.08.004
- Lancaster MA, Renner M, Martin CA, Wenzel D, Bicknell LS, Hurles ME, Homfray T, Penninger JM, Jackson AP, Knoblich JA. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 2013. DOI: 10.1038/nature12517
- Xiang Y, Tanaka Y, Patterson B, Kang YJ, Govindaiah G, Roselaar N, Cakir B, Kim KY, Lombroso AP, Hwang SM, et al. Fusion of region-specific hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 2017. DOI: 10.1016/j.stem.2017.07.007
- Giandomenico SL, Mierau SB, Gibbons GM, Wenger LMD, Masullo L, Sit T, Sutcliffe M, Boulanger J, Tripodi M, Derivery E, et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 2019. DOI: 10.1038/s41593-019-0350-2
转发语：延髓核团体外建模一直是个难点，这篇Cell Stem Cell用定向分化+气液界面培养搞定了脊髓三叉神经核类器官，还和丘脑类器官拼出了带方向性的三叉丘脑投射，痛觉回路研究终于有靠谱的体外模型了。
联系人：李东伟
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