长期扩增的鼠源与人源诱导肾单位祖细胞平台推动类器官成熟与疾病建模
Biao Huang, Zipeng Zeng, Sunghyun Kim, Connor C. Fausto, Kari Koppitch, Hui Li, Zexu Li, Xi Chen, Jinjin Guo, Chennan C. Zhang, Tianyi Ma, Pedro Medina, Megan E. Schreiber, Mateo W. Xia, Ariel C. Vonk, Tianyuan Xiang, Tadrushi Patel, Yidan Li, Riana K. Parvez, Balint Der, Jyun Hao Chen, Zhenqing Liu, Matthew E. Thornton, Brendan H. Grubbs, Yarui Diao, Yali Dou, Ksenia Gnedeva, Qilong Ying, Nuria M. Pastor-Soler, Teng Fei, Kenneth R. Hallows, Nils O. Lindström, Andrew P. McMahon, Zhongwei Li | Cell Stem Cell 2024 | DOI: 10.1016/j.stem.2024.04.002
标签: #肾单位祖细胞 #肾脏类器官 #CRISPR筛选 #常染色体显性多囊肾 #细胞可塑性
一、做什么 🔬
研究背景：肾脏发育与再生研究高度依赖肾单位祖细胞（NPCs），但传统培养体系难以实现NPCs的长期稳定扩增。人多能干细胞（hPSCs）诱导的肾脏类器官长期受困于脱靶细胞分化（神经元与肌细胞占比常超15%）与足细胞发育停滞，导致疾病建模与药物筛选的可靠性受限。
核心问题：
- 能否建立化学成分明确的二维培养体系，实现鼠源与人源NPCs的长期克隆扩增？
- 扩增后的iNPCs能否分化为高纯度、足细胞高度成熟的肾单位类器官？
- 该培养体系能否揭示肾脏发育过程中的细胞可塑性，并支持全基因组CRISPR筛选与ADPKD药物发现？
研究模型：小鼠胚胎肾脏原代NPCs、人多能干细胞诱导的iNPCs、人胎儿肾脏原代细胞。
技术路线：
- 小分子通路调控：在基础培养基中添加p38抑制剂（SB202190）与YAP激动剂（TRULI），维持祖细胞自我更新状态。
- 二维克隆扩增：优化mNPSR-v2与hNPSR-v2培养基，实现单细胞水平的高效克隆形成。
- 类器官定向分化：通过Wnt信号脉冲诱导间充质-上皮转化，生成肾单位类器官。
- 多组学与功能验证：结合单细胞多组学（snRNA-seq + snATAC-seq）与全基因组CRISPR-Cas9筛选，解析基因网络。
- 疾病建模与药筛：利用CRISPR敲除构建PKD1/PKD2突变细胞系，在摇床培养中形成囊肿模型并进行小分子化合物库筛选。
二、发现什么 📊
核心发现1：p38 MAPK信号抑制结合特定小分子组合实现小鼠肾单位祖细胞的高效克隆扩增与多能性维持
图1：添加SB202190等小分子后，小鼠NPCs单细胞克隆形成率达60-70%，SIX2+/PAX2+双阳性细胞比例稳定维持在90%以上，转录组与胚胎期原代NPCs高度重叠。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在原有mNPSR培养基基础上加入SB202190(p38抑制剂)、DAPT(Notch抑制剂)、A83-01(TGF-β抑制剂)、LDN193189(BMP抑制剂)及1.5 μM CHIR99021，构建mNPSR-v2体系；对E11.5-E18.5小鼠肾脏细胞进行单细胞分离与二维培养，通过流式分选与免疫荧光追踪SIX2/PAX2表达，并进行脊髓诱导实验、CAM移植及Bulk RNA-seq分析。 |
| 发现什么 | 培养4天后SIX2+/PAX2+细胞比例从基线提升至90%以上；单细胞克隆形成效率达60-70%；撤除任一添加组分均导致祖细胞标志物表达显著下降；体外诱导7天形成含PODXL+肾小球、LTL+近端小管与CDH1+远端小管的管状结构；PCA分析显示培养细胞与原代E11.5-E13.5 mNPCs在PC1/PC3轴高度重合，差异基因数<50个。 |
| 说明什么 | 证实p38通路活性下调是维持小鼠NPCs自我更新的核心开关，mNPSR-v2体系成功突破了传统三维培养难以兼容高通量操作的瓶颈，为后续全基因组筛选与跨品系细胞系建立提供了标准化、高纯度的二维扩增平台。 |
三、说明什么 💡
领域意义：传统hPSC来源肾脏类器官长期受困于脱靶分化与足细胞发育停滞。该研究通过优化祖细胞起始质量与培养微环境，将类器官纯度提升至脱靶细胞<0.7%，并首次在体外重现足细胞基底膜关键组分COL4A3/COL4A4的高表达，确立了“高质量祖细胞决定类器官终末分化上限”的新共识。同时，研究证实已分化足细胞在特定微环境下可逆转为祖细胞样状态，打破了肾脏发育单向分化的传统认知。
临床/转化价值：
- 建立可长期传代、基因编辑效率高的iNPC细胞库，直接加速遗传性肾病（如Alport综合征、Wilms瘤）的机制解析。
- 揭示已分化足细胞在特定微环境下可逆转为祖细胞样状态（rNPC），为终末期肾病细胞重编程与再生治疗提供新靶点。
- 开发基于摇床培养的微型囊肿高通量筛选模型，成功鉴定出BMI-1抑制剂PTC-209具有剂量依赖性抑制囊肿生长的潜力，为ADPKD老药新用提供先导化合物。
与我们产品的关联：该研究依赖二维高密度克隆培养、单细胞多组学建库与微型3D类器官摇床培养。我们的仪器可精准覆盖其扩增、分化与表型分析环节。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐ | 论文采用传统96孔板与摇床培养，未使用生物打印。若需构建血管化或空间结构更复杂的肾脏组织模型，BIO X6可替代传统聚集体培养，实现多细胞类型精准空间排布。 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐ | 研究未涉及电生理记录。若后续需评估成熟肾单位类器官的离子通道功能或药物对管腔转运的实时电生理影响，HD-MEA可提供无标记动态监测。 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 论文依赖静态二维与摇床三维培养。Celvivo微流控灌注系统可模拟肾小球滤过压与管腔剪切力，用于验证iNPC类器官在生理流体环境下的足细胞裂孔隔膜形成与药物代谢动力学。 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐⭐⭐ | 研究核心在于单细胞克隆扩增与高通量药筛。SIEVEWELL的高通量微孔阵列可直接替代传统96孔板，实现单细胞克隆的自动化挑取、长期原位培养与囊肿表型的高内涵成像分析。 |
参考文献
- Huang B, Zeng Z, Kim S, et al. Long term expandable mouse and human induced nephron progenitor cells enable kidney organoid maturation and modeling of plasticity and disease. Cell Stem Cell. 2024;31(6):921-939.e17. DOI: 10.1016/j.stem.2024.04.002
- Takasato M, Er PX, Chiu HS, et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 2015;526(7574):564-568. DOI: 10.1038/nature15695
- Morizane R, Nguyen NQ, Biju KB, et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nat Biotechnol. 2015;33(11):1193-1200. DOI: 10.1038/nbt.3392
- Freedman BS, Brooks CR, Lam AQ, et al. Modelling polycystic kidney disease in human organoids. Nature. 2015;526(7574):572-576. DOI: 10.1038/nature15695
转发语：肾脏类器官终于告别“脱靶多、足细胞不成熟”的痛点。这篇Cell Stem Cell用一套二维培养基把祖细胞扩增效率拉到60%以上，还顺手发现了多囊肾新靶点，做肾脏发育和药筛的同行可以直接抄作业了。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：Cell Stem Cell 2024 Long term expandable mouse and human induced nephron