iPSC及其多谱系衍生物在3D悬浮体系中的规模化扩增与分化策略
郭志强, 伊莎贝尔·塞巴斯蒂安, 克里蒂卡·哈里哈兰, 伊娜·迈瑟, 珍妮特·维汉, 萨斯基娅·阿尔特迈尔, 伊莎贝尔·卡纳茨, 多米尼克·鲍尔, 本杰明·费舍尔, 亚历山大·费勒, 阿尔弗雷多·卡布雷拉-索科罗, 米克尔·拉斯穆森, 比约恩·霍尔斯特, 朱莉娅·C·诺伊鲍尔, 克里斯蒂安·克劳森, 凯瑟琳·维尔法耶, 安德烈亚斯·埃布内特, 马蒂亚斯·汉森, 瑞秋·斯蒂格, 海科·齐默尔曼 | Reproductive Toxicology 2022 | 10.1016/j.reprotox.2022.05.007
标签: #iPSC规模化扩增 #3D悬浮培养 #多谱系定向分化 #台式生物反应器 #体外毒性筛选
一、做什么 🔬
研究背景：诱导多能干细胞（iPSC）在毒性测试、疾病建模与细胞治疗中需求激增，但传统2D贴壁扩增依赖平行增加培养容器，劳动密集且耗材成本高昂。中空纤维与自动化2D系统虽能提升表面积，但存在监测困难、易堵塞或设备投资过大的瓶颈。3D悬浮培养通过增加体积而非占地面积实现线性放大，已成为干细胞生物加工的主流方向，但不同3D格式（微载体附着、聚集体悬浮）对扩增效率、多能性维持及下游分化兼容性的系统对比仍缺乏标准化数据。
核心问题：
- 能否在台式生物反应器中建立无需ROCK抑制剂或低剪切应力的iPSC3D悬浮扩增方案？
- 微载体附着、单细胞微载体与无载体聚集体三种格式在细胞倍增率与多能性维持上存在何种量化差异？
- 该3D扩增体系能否直接衔接至神经、心脏、肝脏谱系分化，并在多供体/疾病背景下保持高产出与表型一致性？
研究模型：5种EBiSC注册iPSC细胞系（含健康对照UKBi005-A、长QT综合征UKKi018-A、NGN2转基因编辑系BIONi010-C-13及CYP3A4报告基因系），在CERO 3D台式悬浮生物反应器中进行扩增与定向分化。
技术路线：
- 3D悬浮扩增：对比团块接种于Matrigel涂层海藻酸盐微载体、单细胞接种于微载体、单细胞自组装聚集体三种培养格式
- 多能性QC：流式细胞术定量SSEA-4/TRA-1-60/POU5F1及分化标记SSEA-1
- 定向分化：NGN2诱导神经元分化（2-5天）、WNT通路调控心脏分化（8天）、三阶段肝类器官分化（21天）
- 功能验证：qPCR标志物表达、搏动球体比例统计、cTNT/Ki-67流式分析、类器官形态与代谢活性评估
二、发现什么 📊
核心发现1：建立涵盖2D贴壁、3D微载体与3D聚集体的iPSC扩增及多谱系分化标准化工作流
图1：图示展示从2D平面培养向3D微载体/聚集体扩增的转化路径，并衔接至神经、心脏、肝脏三大谱系分化及下游毒性/功能测试应用场景。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 绘制并验证从2D贴壁传代到3D悬浮培养（微载体/聚集体）的完整工艺管线，明确各节点的培养基替换、传代时机与下游分化接口 |
| 发现什么 | 工作流覆盖5种不同遗传背景iPSC系，在CERO 3D系统中实现从扩增到神经/心脏/肝分化的无缝衔接，各节点培养体积与转速参数可独立调节 |
| 说明什么 | 证明单一台式生物反应器平台可替代多层培养皿与大型搅拌罐，为EBiSC细胞库提供标准化、可并行的生物加工模板，降低跨实验室工艺转移门槛 |
核心发现2：3D单细胞微载体培养实现最高扩增效率，且三种格式均维持>90%多能性标记阳性率
图2：三种3D扩增格式的细胞形态对比显示单细胞微载体覆盖最均匀；日倍增率分别为0.33±0.19（团块）、1.48±0.25（单细胞微载体）、1.07±0.13（聚集体）；流式显示多能性标记阳性率>90%，SSEA-1<5%。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将UKBi005-A与BIONi010-C细胞系分别以团块、单细胞接种于Matrigel涂层海藻酸盐微载体，或诱导形成聚集体，在CERO 3D中培养3-7天，记录形态、细胞计数与流式多能性标记 |
| 发现什么 | 单细胞微载体日倍增率达1.48±0.25（培养3-4天达汇合），显著高于团块（0.33±0.19）与聚集体（1.07±0.13）；三种格式终末传代时SSEA-4/TRA-1-60/POU5F1阳性率均>90%，分化标记SSEA-1<5% |
| 说明什么 | 微载体提供更大附着表面积且单细胞接种均一性最佳，无需ROCK抑制剂的团块法虽生长较慢但规避了基因组不稳定性风险，为不同下游应用提供可切换的扩增策略 |
核心发现3：NGN2诱导的神经元分化在3D体系中2天即可实现>8倍扩增，多能性标记下调900倍
图3：2D、3D聚集体与3D微载体条件下第2天细胞产量分别为7.0±2.4、8.1±4.0、9.5±5.1倍；POU5F1在第5天微载体条件下下调900倍；MAPT相对倍数变化分别为128、204、81；冻存复苏存活率>85%。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 使用BIONi010-C-13系在2D孔板、3D聚集体、3D微载体中接种，添加多西环素诱导NGN2表达，于第2天与第5天取样进行qPCR（POU5F1/TUBB3/MAP2/MAPT）与ICC染色，并测试冻存复苏率 |
| 发现什么 | 第2天产量：2D为7.0±2.4倍，3D聚集体8.1±4.0倍，3D微载体9.5±5.1倍；第5天POU5F1下调达900倍；MAPT表达倍数在2D/3D聚集体/3D微载体分别为128、204、81；冻存复苏存活率>85%且Tubb3/Nestin蛋白表达完整 |
| 说明什么 | 3D悬浮格式在极短周期内实现与2D相当甚至更高的神经元前体扩增，且多能性退出与神经谱系启动动力学一致，证明3D体系可直接用于高通量神经毒性筛选的细胞制备 |
核心发现4：优化WNT通路调控方案使难分化疾病系搏动球体比例从0%提升至86.2%，cTNT阳性率达98%
图4：优化方案（OP）使UKKi018-A搏动球体比例从标准方案（SP）的0%升至86.2%，UKBi005-A从63.5%升至98.5%；第8天心肌细胞cTNT阳性率约98%，Ki-67共表达显示高增殖活性；qPCR显示ACTN2/MYH7/TNNT2高表达。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对比标准方案（SP）与优化方案（OP：Activin A 20 ng/ml, BMP4 2 ng/ml, CHIR99021 3 µM, Wnt-C59 2 µM）在UKBi005-A与UKKi018-A中的分化效果，统计第7天搏动球体比例、第8天细胞产量、流式cTNT/Ki-67及qPCR心脏标志物 |
| 发现什么 | OP方案使UKKi018-A搏动比例从0%跃升至86.2%，UKBi005-A从63.5%升至98.5%；细胞产出比始终>150%；流式显示cTNT阳性率约98%，Ki-67高表达；qPCR证实ACTN2/MYH7/TNNT2稳定上调，ISL-1低变异表达 |
| 说明什么 | 提高WNT激活/抑制浓度可克服疾病相关iPSC系的谱系分化阻滞，实现跨供体稳健分化；第8天细胞虽未完全成熟（Ki-67高），但高增殖特性为后续大规模扩增与电生理成熟提供充足起始材料 |
核心发现5：21天3D悬浮分化成功生成结构致密的肝类器官，第4-21天类器官直径增大而数量因融合减少
图5：肝类器官在第3-4天结构趋于致密，第4-21天直径缓慢增大，数量同步下降；显微图像显示类器官形态随三阶段培养基切换发生规律性演变。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将iPSC以4×10⁵ cells/ml接种于CERO 3D，添加0.3%甲基纤维素防聚集，按终末内胚层→肝前体→类肝细胞三阶段培养基培养21天，每日记录类器官直径与数量，拍摄形态演变 |
| 发现什么 | 第3-4天聚集体显著致密化；第4-21天类器官直径持续缓慢增大，同时数量因2个以上类器官融合而下降；形态变化与阶段2至阶段3培养基切换时间点高度吻合 |
| 说明什么 | 3D悬浮体系可稳定支持肝类器官长期发育，类器官融合导致的数量下降可通过动态调节转速控制剪切力来干预；该格式保留了生理性细胞-细胞接触，为CYP3A4等代谢酶功能评估提供高保真模型 |
三、说明什么 💡
领域意义：该研究将3D悬浮培养从“可行选项”推升为iPSC规模化扩增的“标准工艺”。过去学界普遍认为微载体附着或聚集体培养需针对特定细胞系反复滴定ROCK抑制剂浓度，且担忧基因组稳定性受损。本研究通过平行对比证明：单细胞微载体可实现>1.48倍/日的高效扩增，而无需ROCK抑制剂的团块法虽增速较慢（0.33倍/日）但完全规避了单细胞应激风险。这打破了“高效扩增必须依赖ROCK抑制”的单一认知，确立了按下游应用需求灵活选择3D格式的新共识。
临床/转化价值：
- 为EBiSC等公共细胞库提供可复制的放大SOP，使健康/疾病iPSC系能以统一标准分发至毒理与药筛实验室
- 优化后的心脏分化方案消除疾病系分化阻滞，使长QT综合征等遗传病模型可直接用于CiPA离子通道安全性评估
- 肝类器官21天悬浮培养保留代谢活性，可替代原代肝细胞（PHH）用于药物肝毒性高通量初筛，解决PHH批次差异大、存活窗口短的痛点
与我们产品的关联：论文核心设备为CERO 3D台式生物反应器。若要在该工作流基础上开展下游功能验证或高通量筛选，需补充微电极阵列记录、类器官长期维持与多孔板平行测试模块。我们的产品线可精准填补这些环节。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐ | 用于3D扩增后的心肌细胞/神经元在2D涂层板上的成熟铺板，或肝类器官向微流控芯片的转移接种，提供高精度、低剪切力的自动化分配 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐⭐⭐ | 论文讨论明确指出第8天心肌细胞需在2D培养1-2周后测量场电位。HD-MEA可直接承接该步骤，实现无标记、高通量的心肌/神经元电生理毒性评估 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 适用于肝类器官21天分化后期的长期动态培养，提供低剪切力灌注环境，维持CYP3A4等代谢酶活性，弥补静态生物反应器在长周期培养中的营养梯度缺陷 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐ | 若将3D扩增后的iPSC衍生细胞转移至96/384孔板进行化合物毒性初筛，SIEVEWELL的均一微环境可提升孔间一致性，但需客户自行建立3D至2D/3D微孔的转移SOP |
参考文献
- Kwok CK, Sébastien I, Hariharan K, Meiser I, Viehan J, Altmaier S, Kanatz I, Bauer D, Fischer B, Feller A, Cabrera-Socorro A, Rasmussen M, Holst B, Neubauer JC, Clausen C, Verfaillie C, Ebneth A, Hansson M, Steeg R, Zimmermann H. Scalable expansion of iPSCs and their derivatives across multiple lineages. Reproductive Toxicology. 2022. 10.1016/j.reprotox.2022.05.007
- Zhang M, Schulte JS, Heinick A, Piccini I, Rao J, Quaranta R, Zeuschner D, Malan D, Kim KP, Röpke A, Sasse P, Araújo-Bravo M, Seebohm G, Schöler H, Fabritz L, Kirchhof P, Müller FU, Greber B. Universal induction of cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells in 2D and 3D formats: implications for in vitro maturation. Stem Cells. 2015. 10.1002/stem.1964
- Shih PY, Kreir M, Kumar D, Seibt F, Pestana F, Schmid B, Holst B, Clausen C, Steeg R, Fischer B, Pita-Almenar J, Ebneth A, Cabrera-Socorro A. Development of a fully humanized assay combining NGN2-induced neurons with iPSC-derived astrocytes for electrophysiological studies. Stem Cell Research. 2021. 10.1016/j.scr.2021.102386
- Altmaier S, Meiser I, Lemesre E, Chanrion B, Steeg R, Leonte LE, Holst B, Nielsen BS, Clausen C, Schmidt K, Vinggaard AM, Zimmermann H, Neubauer JC, Rasmussen MA. 2D and 3D suspension culture of human iPSC-derived hepatocytes for cryopreservation and in vitro toxicology studies. Reproductive Toxicology. 2022. 10.1016/j.reprotox.2022.05.005
- Zweigerdt R, Olmer R, Singh H, Haverich A, Martin U. Scalable expansion of human pluripotent stem cells in suspension culture. Nature Protocols. 2011. 10.1038/nprot.2011.318
转发语：一篇把iPSC放大和分化讲透的工艺指南，3种悬浮格式怎么选、心脏/神经/肝怎么无缝衔接，数据全给齐了，做毒理和细胞库的可以直接抄作业。
联系人：李东伟
📞 18045130660 🌐 https://www.biokingdom.top
📥 下载原文PDF：Reproductive Toxicology 2022 iPSC Scalable Expansion