人iPSC来源肝细胞在二维与三维悬浮培养中的冻存及体外毒性研究
Saskia Altmaier, Ina Meiser, Emilie Lemesre, Benjamin Chanrion, Rachel Steeg, Lidia Elena Leonte, Bjørn Holst, Boye Schnack Nielsen, Christian Clausen, Katharina Schmidt, Anne Marie Vinggaard, Heiko Zimmermann, Julia Christiane Neubauer, Mikkel Aabech Rasmussen | Reproductive Toxicology 2022 | DOI: 10.1016/j.reprotox.2022.05.005
标签: #iPSC肝细胞分化 #3D类器官 #程序降温冻存 #高通量毒性筛选 #CYP3A4报告基因 #生物反应器放大
一、做什么 🔬
研究背景：原代人肝细胞（PHH）是评估药物肝毒性的金标准，但供体稀缺且体外培养易去分化。人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的肝样细胞（HLCs）具备无限扩增潜力，但现有分化方案多局限于二维培养，难以满足高通量筛选与规模化生产需求。三维悬浮类器官更贴近体内微环境，但缺乏标准化的放大培养与冻存复苏策略，导致批次间差异大、代谢功能不稳定。
核心问题：
- 能否建立一套兼容二维与三维悬浮体系的标准化hiPSC肝细胞分化流程？
- CYP3A4代谢报告基因能否替代传统ATP检测，实现更灵敏的亚致死性肝毒性评估？
- 肝前体阶段与终末分化阶段的类器官，在程序降温冻存后的表型恢复能力是否存在显著差异？
- 分化流程能否直接平移至384孔板，满足高通量药物筛选的微型化需求？
研究模型：CRISPR编辑的CYP3A4-Nanoluc报告hiPSC系（BIONi010-C），二维单层培养与CERO 3D无叶轮悬浮生物反应器三维培养。
技术路线：
- 基因编辑报告系构建：在CYP3A4基因终止密码子前插入T2A-Nanoluc，实现成熟度实时发光监测
- 三阶段定向分化：Activin A/CHIR99021诱导定形内胚层（DE）→ KOSR/DMSO诱导肝前体（HP）→ HGF/OSM/地塞米松诱导成熟HLC
- 悬浮生物反应器放大：CERO 3D体系优化接种密度、转速与甲基纤维素黏度，生成均一类器官
- 程序降温冻存：VIA Freeze控制降温速率（1°C/min），对比D8（HP期）与D21（成熟期）冻存节点
- 微型化与毒性测试：384孔板密度优化，平行使用Nano-Glo与CellTiter-Glo评估双氯芬酸等药物毒性
二、发现什么 📊
核心发现1：二维三阶段分化流程确立，定形内胚层诱导效率超90%
图1：D3阶段SOX17/FOXA2双阳性细胞比例达90%以上，D24细胞呈典型多边形并稳定表达6项肝成熟标志物
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 建立hiPSC→DE→HP→HLC的二维分化方案，D0接种0.5×10^5 cells/cm²，D3添加Activin A与CHIR99021，D10添加HGF/OSM，D17-24补充氢化可的松与胆固醇脂质浓缩物 |
| 发现什么 | D3时SOX17/FOXA2双阳性细胞比例>90%；D24细胞呈现大角度多边形形态，免疫荧光稳定检出HNF4A、AFP、ALB、CK18、A1AT、CYP3A4 |
| 说明什么 | 明确三阶段诱导的表型转化节点，为后续三维放大与毒性测试提供可重复的形态与分子基准 |
核心发现2：无叶轮悬浮生物反应器实现肝类器官标准化扩增
图2：接种8×10^6 cells/20 ml、转速60 rpm并添加0.3%甲基纤维素，成功生成直径约200 μm的均一肝类器官
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将二维培养基成分平移至CERO 3D无叶轮生物反应器，设定旋转周期2 s、暂停0 s、转速60 rpm，添加0.3%甲基纤维素调节黏度，诱导三维自组装 |
| 发现什么 | 初始接种密度8×10^6 cells/20 ml条件下，类器官直径稳定在约200 μm，形态均一，无剪切力损伤导致的细胞碎片聚集 |
| 说明什么 | 低剪切力悬浮体系可消除传统搅拌生物反应器的机械应力，实现肝类器官的批次一致性生产，为下游冻存提供标准化起始材料 |
核心发现3：CYP3A4报告基因活性与分化进程高度同步
图3：分化期间CYP3A4-Nanoluc发光信号持续上升，D24时较D0提升显著，与qPCR基因表达趋势完全一致（p<0.001）
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 利用CRISPR编辑的CYP3A4-Nanoluc报告系，在D0、D3、D10、D17、D24采集样本，同步进行Nano-Glo发光检测与CellTiter-Glo ATP归一化，并行qRT-PCR检测HNF4A、AFP、ALB、CYP3A4 |
| 发现什么 | Nano-Glo发光强度随分化时间呈阶梯式上升，D17-D24阶段增幅最显著；发光曲线与CYP3A4 mRNA表达量呈正相关（p<0.001） |
| 说明什么 | 报告基因系统可非裂解性、实时量化肝细胞代谢成熟度，替代传统终点法PCR，大幅缩短功能评估周期 |
核心发现4：代谢报告基因检测灵敏度远超传统ATP存活率法
图4：Nano-Glo在双氯芬酸≥50 μM时即显示CYP3A4活性阶梯式下降，CellTiter-Glo仅在500 μM时检出存活率降低
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | D21 HLCs暴露于对乙酰氨基酚（0-10000 μM）、双氯芬酸（0-500 μM）、吡格列酮（0-40 μM）共7天，每3天换液，D28平行进行Nano-Glo与CellTiter-Glo检测 |
| 发现什么 | 双氯芬酸组Nano-Glo在≥50 μM时CYP3A4活性即显著下降；CellTiter-Glo仅在500 μM时显示ATP水平降低；吡格列酮组两种检测均无变化 |
| 说明什么 | 代谢功能报告基因比细胞存活率检测灵敏度高出一个数量级，能在细胞未发生明显死亡前捕捉亚致死性肝毒性，优化浓度-效应曲线构建 |
核心发现5：384孔板微型化方案兼容高通量初筛
图5：73,000 cells/cm²（约8,000 cells/孔）密度下，D10时ALB/CYP3A4/HNF4A表达量与96孔板等效，但17天后出现贴壁脱落
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 复苏冻存D3 DE细胞，以不同密度接种至384孔板，D15评估ALB、AFP、HNF4A表达；D10/D17进行PAS糖原染色、AdipoRed脂质积累与ICG摄取/释放实验 |
| 发现什么 | 最佳密度为73,000 cells/cm²（8,000 cells/孔）；D10时肝标志物表达与96孔板相当，细胞具备ICG摄取与糖原储存功能；培养至17天后384孔板细胞形态纤维化并脱落 |
| 说明什么 | 384孔板适用于早期肝毒性高通量初筛，但需优化基质涂层或培养基配方以维持长期成熟表型，避免微型化带来的贴壁稳定性下降 |
核心发现6：肝前体阶段（D8）为类器官冻存的最佳时间窗口
图6：D8冻存组复苏第7天存活率达43%且CYP3A4活性完全恢复，D21冻存组复苏后标志物表达持续低于对照
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将D8（HP期）与D21（成熟期）类器官经VIA Freeze以1°C/min降温至-80°C冻存，复苏后于0 h、24 h、3 d、7 d、14 d检测形态、CYP3A4发光活性、qPCR与免疫荧光 |
| 发现什么 | D8冻存组复苏24 h后CYP3A4活性下降17%，第3天恢复至未冻存对照水平，第7天存活率达43%；D21冻存组复苏24 h后活性下降25%，第3天仅检出ALB与A1AT，CYP3A4与HNF4A持续缺失 |
| 说明什么 | 终末分化阶段细胞对冻存损伤极度敏感，肝前体阶段（D8）具备更强的抗逆性与表型可塑性，是建立“现货型”肝类器官库存的唯一可行节点 |
三、说明什么 💡
领域意义：该研究将hiPSC肝细胞分化从二维静态培养推进至三维无叶轮悬浮体系，证实了低剪切力生物反应器在类器官标准化生产中的可行性。通过CYP3A4-Nanoluc报告基因与程序降温冻存策略的结合，打破了传统肝毒性检测依赖ATP存活率的滞后性，同时明确了D8肝前体阶段为冻存黄金窗口。此前学界普遍认为成熟类器官更适合直接冻存，该数据直接推翻了这一假设，确立了“冻存前体、复苏后成熟”的新范式。
临床/转化价值：
- 建立可规模化、批次稳定的肝类器官生产管线，降低原代肝细胞依赖，加速新药临床前肝毒性评估
- 代谢报告基因系统可直接嵌入384孔板筛选流程，实现亚致死毒性早期预警，减少后期临床失败率
- D8冻存策略使肝类器官具备“现货”属性，支持多中心实验室随时调用，推动体外毒理学标准化
与我们产品的关联：
- 论文核心依赖无叶轮悬浮生物反应器与程序降温冻存仪，微型化筛选依赖高内涵成像与发光检测。我们的3D培养平台与高通量筛选设备可直接复现该工作流。
- 报告基因发光检测与类器官形态追踪环节，与我们的成像及微孔板分析系统高度匹配。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐ | 论文使用CERO 3D悬浮体系，Cellink可通过生物打印构建肝类器官支架或微流控芯片，用于替代传统悬浮培养，提升类器官长期培养稳定性 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐ | 肝细胞非电兴奋性细胞，MEA不直接适用；但CorePlate微电极阵列可用于监测类器官代谢微环境变化（如pH/离子波动），需客户自行开发适配方案 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 三维微流控灌注培养系统可模拟肝窦血流剪切力，用于验证论文中无叶轮悬浮体系生成的类器官在动态灌注下的代谢成熟度与药物清除率 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 384孔板微型化筛选与CYP3A4发光检测直接对应SIEVEWELL的高通量成像与孔板分析能力，可无缝承接论文中的毒性初筛与标志物定量工作流 |
参考文献
- Altmaier S, Meiser I, Lemesre E, et al. Human iPSC-derived hepatocytes in 2D and 3D suspension culture for cryopreservation and in vitro toxicity studies. Reproductive Toxicology. 2022. DOI: 10.1016/j.reprotox.2022.05.005
- Carpentier A, et al. Miniaturization of hepatocyte differentiation from human pluripotent stem cells in microwell plates. Stem Cell Research. 2016. DOI: 10.1016/j.scr.2016.08.012
- Bell CC, et al. Comparison of hepatic 2D sandwich cultures and 3D spheroids for long-term toxicity applications. Toxicological Sciences. 2018. DOI: 10.1093/toxsci/kfy038
- Pettinato G, et al. Generation of functional hepatocyte-like organoids from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 2016. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2016.05.024
转发语：这篇研究把hiPSC肝细胞分化直接搬进3D悬浮生物反应器，还摸清了D8肝前体才是冻存黄金期。用CYP3A4发光报告基因测肝毒性，比传统ATP法灵敏得多，50 μM双氯芬酸就能抓到早期损伤信号。做高通量毒理和类器官放大的团队可以直接抄作业。
联系人：李东伟
📞 18045130660 🌐 https://www.biokingdom.top
📥 下载原文PDF：Reproductive Toxicology 2022 Human iPSC-derived hepatocytes