人源iPSC衍生肝细胞2D/3D培养体系建立与冷冻保存及毒性评估
萨斯基亚·阿尔特迈尔，伊娜·迈泽尔，埃米莉·勒梅尔，本杰明·尚里昂，雷切尔·斯蒂格，莉迪亚·埃琳娜·莱昂特，比约恩·霍尔斯特，博伊·施纳克·尼尔森，克里斯蒂安·克劳森，卡塔琳娜·施密特，安妮·玛丽·温加德，海科·齐默尔曼，茱莉亚·克里斯蒂安·诺伊鲍尔，米克尔·奥贝赫·拉斯穆森 | Reproductive Toxicology 2022 | 10.1016/j.reprotox.2022.05.005
标签: #iPSC肝向分化 #3D类器官培养 #高通量毒性筛选 #程序化冷冻保存 #CYP3A4报告基因
一、做什么 🔬
研究背景：原代人肝细胞（PHH）是评估药物肝毒性的金标准，但供体稀缺且体外培养中功能衰退迅速。人诱导多能干细胞（hiPSC）分化的肝样细胞（HLCs）具备无限扩增潜力，可弥补PHH的供应缺口。现有hiPSC肝向分化方案在二维单层培养中已相对成熟，但向三维悬浮体系规模化转化、微孔板高通量适配以及三维类器官的标准化冷冻保存仍存在技术断层，限制了其在工业级毒理筛选中的稳定应用。
核心问题：
- 能否建立稳定、可规模化的2D/3D hiPSC向肝样细胞分化体系？
- 微型化培养（384孔板）能否维持肝细胞表型并直接用于高通量毒性筛选？
- 肝类器官在分化不同阶段（第8天祖细胞 vs 第21天成熟细胞）经程序化冷冻后，其复苏存活率与功能标志物表达能否有效恢复？
研究模型：CRISPR-Cas9基因编辑的CYP3A4-NanoLuc报告hiPSC系（BIONi010-C），在2D单层与3D悬浮生物反应器中分化为肝样细胞及肝类器官。
技术路线：
- 基因编辑报告系构建：在CYP3A4基因终止密码子上游插入T2A-NanoLuc序列，实现成熟度实时发光监测。
- 2D分化优化与微型化：优化三阶段（定型内胚层→肝祖细胞→肝样细胞）培养基配方，适配384孔板高通量筛选。
- 3D悬浮生物反应器培养：将2D方案转移至CERO 3D无叶轮生物反应器，优化初始接种密度（8×10^6细胞/20 mL）与转速（60 rpm）。
- 程序化冷冻保存：对比第8天（肝祖细胞阶段）与第21天（成熟肝细胞阶段）类器官的慢速冷冻（1°C/min至-80°C）复苏效果。
- 体外毒理学验证：使用对乙酰氨基酚、双氯芬酸、吡格列酮处理，对比Nano-Glo（CYP3A4活性）与CellTiter-Glo（ATP活力）检测灵敏度。
二、发现什么 📊
核心发现1：2D分化流程建立与定型内胚层高效冻存策略
图1：2D分化流程显示hiPSC经3天诱导后定型内胚层（DE）纯度超90%，第3天DE细胞冻存后复苏分化效率与新鲜细胞一致。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 采用三阶段培养基诱导hiPSC分化，第3天收集定型内胚层（DE）细胞，使用10% DMSO/KOSR冻存液进行程序化冷冻，复苏后继续完成后续肝祖细胞与肝样细胞分化。 |
| 发现什么 | 第3天DE细胞中SOX17/FOXA2双阳性比例达到92.4%±3.1%（n=3）。冻存复苏后的DE细胞在后续分化中，第17天白蛋白（ALB）表达量与未冻存对照组相比差异小于8%。 |
| 说明什么 | 定型内胚层阶段具备稳定的冻存耐受性，可作为标准化“细胞库”中间产物，消除批次间差异，为下游高通量实验提供均质起始材料。 |
核心发现2：3D悬浮生物反应器规模化培养与双时间点冷冻设计
图2：3D悬浮培养体系在CERO生物反应器中实现230个类器官/mL的均质产量，并在第8天与第21天设置冷冻对照以评估复苏窗口。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将2D分化方案转移至CERO 3D无叶轮生物反应器，设定初始接种密度8×10^6细胞/20 mL，转速60 rpm，旋转周期2秒/暂停0秒。在分化第8天（肝祖细胞）与第21天（成熟肝样细胞）收集类器官进行慢速冷冻（1°C/min）。 |
| 发现什么 | 优化参数后，每毫升培养基可稳定生成230±15个直径约200 μm的均质肝类器官。第8天与第21天类器官均成功冻存，为后续复苏动力学对比提供平行样本。 |
| 说明什么 | 无叶轮低剪切力环境有效维持了类器官三维结构完整性，规模化参数确立为后续工业化生产提供了可复制的工程基准。 |
核心发现3：2D肝样细胞形态演变与多标志物免疫荧光验证
图3：第24天肝样细胞呈现典型多角形形态，免疫荧光显示HNF4A、CYP3A4、ALB、CK18、A1AT、AFP 6项标志物均呈强阳性表达。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在分化第0、3、6、10、17、24天进行明场形态学观察，并于第24天对单层细胞进行多通道免疫荧光染色（HNF4A、AFP、CYP3A4、ALB、CK18、A1AT），使用共聚焦显微镜定量荧光强度。 |
| 发现什么 | 第24天细胞呈现清晰多角形结构，单/双核仁明显。6项标志物荧光强度较第10天提升3.2~5.8倍，其中CYP3A4与ALB阳性细胞占比达85%±4%。 |
| 说明什么 | 2D分化终点细胞已具备成熟肝细胞典型形态与分子特征，标志物共表达验证了分化方案的高均一性，满足体外毒理模型的基础表型要求。 |
核心发现4：CYP3A4报告基因动态监测与高灵敏度毒性检测
图4：CYP3A4报告基因活性随分化持续上升；双氯芬酸在≥50 μM时Nano-Glo信号下降42%，而CellTiter-Glo仅在500 μM检出毒性。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 利用CYP3A4-NanoLuc报告系，在分化第0-24天连续检测发光值。第21天起分别用对乙酰氨基酚（0-10000 μM）、双氯芬酸（0-500 μM）、吡格列酮（0-40 μM）处理7天，同步读取Nano-Glo（CYP3A4活性）与CellTiter-Glo（ATP活力）。 |
| 发现什么 | Nano-Glo信号随分化呈线性上升，第24天达基线值的6.4倍。双氯芬酸在50 μM时Nano-Glo信号下降42%（p<0.01），CellTiter-Glo仅在500 μM时显示存活率降至对照的35%。吡格列酮全浓度组无显著变化。 |
| 说明什么 | CYP3A4代谢活性下降早于ATP耗竭，Nano-Glo报告系统对早期亚致死肝毒性敏感度比传统ATP检测高10倍，可大幅缩短毒性筛选窗口。 |
核心发现5：384孔板微型化分化可行性与标志物定量分析
图5：384孔板最佳接种密度为每孔8000个细胞（约73000个/cm²），第17天肝细胞标志物ALB与CYP3A4表达量较第10天提升2.5倍以上。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将冻存复苏的DE细胞以不同密度接种至384孔板，优化后确定每孔8000个细胞。在第10、17天进行ALB、CYP3A4、AFP、HNF4A免疫荧光染色，使用高内涵成像系统定量单细胞荧光强度。 |
| 发现什么 | 73000个/cm²密度下细胞铺展均匀。第17天ALB与CYP3A4荧光强度较第10天分别提升2.7倍与2.9倍（p<0.001），AFP与HNF4A强度下降至第10天的41%。 |
| 说明什么 | 384孔板微型化体系可完整复现肝向分化轨迹，标志物动态变化符合发育规律，为自动化高通量药物筛选提供了标准化微孔平台。 |
核心发现6：肝细胞特异性代谢功能在微孔板中的恢复
图6：第10天起微孔板内细胞即可有效摄取并释放吲哚菁绿（ICG），PAS与AdipoRed染色证实糖原与脂质储存功能恢复。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在96孔与384孔板分化第10、17、24天进行ICG摄取/释放实验（1 mg/mL孵育30 min，新鲜培养基追踪6 h），同步进行PAS糖原染色与AdipoRed脂质染色，光学/共聚焦显微镜成像。 |
| 发现什么 | 第10天细胞ICG摄取率达78%，6 h释放率达65%。PAS染色显示糖原颗粒覆盖率达62%±5%，AdipoRed显示脂滴阳性细胞占比54%±6%。 |
| 说明什么 | 微型化培养的肝样细胞在分化早期即具备阴离子转运、糖原合成与脂质代谢等核心生理功能，验证了其在代谢型毒性评价中的实用价值。 |
三、说明什么 💡
领域意义：该研究将hiPSC肝向分化从实验室级2D培养推进至可规模化的3D悬浮体系，并首次系统验证了中间态（第8天肝祖细胞）类器官的程序化冷冻可行性。过去学界普遍认为成熟类器官（>21天）是毒性测试的唯一标准模型，本研究证明祖细胞阶段冻存后复苏3天即可恢复CYP3A4活性至未冻存对照的91%，打破了“必须冻存终末产物”的传统认知。3D类器官冻存后的功能恢复差异也揭示了细胞间连接密度对冰晶损伤的放大效应，为后续低温保护剂配方优化提供了明确靶点。
临床/转化价值：
- 建立标准化、可冻存的hiPSC肝细胞中间库，解决原代肝细胞批次差异大、供应不稳定的行业痛点。
- Nano-Glo报告系统实现亚致死肝毒性早期预警，可将药物临床前筛选周期缩短30%以上。
- 384孔板微型化方案直接兼容自动化液体处理工作站，为工业级高通量毒理筛选提供即插即用模型。
与我们产品的关联：
- 384孔板微型化与高内涵成像流程高度依赖自动化微孔培养与实时监测设备。
- 3D悬浮类器官的规模化扩增需要低剪切力、参数可控的培养环境。
- 程序化冷冻与复苏后的功能验证需要标准化温控与发光检测设备。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐ | 论文使用CERO生物反应器进行悬浮培养，Cellink可通过生物打印或微流控模块实现肝类器官的3D空间排布与高通量阵列化培养，替代传统悬浮管提升均一性。 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐ | 本研究聚焦代谢与生化毒性，未涉及电生理检测。若客户需拓展肝细胞膜电位或离子通道毒性评估，HD-MEA可提供无标记实时电生理读数。 |
| Celvivo | ⭐⭐ | Celvivo提供标准化3D微环境培养平台，适用于肝类器官的长期维持与药物渗透性测试，可作为CERO生物反应器的补充，用于小批量高价值样本的静态3D培养。 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 论文核心转化路径为384孔板微型化高通量筛选。SIEVEWELL的微流控/微孔阵列设计可直接对接该方案，实现培养基自动更换、药物梯度生成与实时发光监测，完美匹配工业级毒理筛选需求。 |
参考文献
- Altmaier S, Meiser I, Lemesre E, Chanrion B, Steeg R, Leonte LE, Holst B, Nielsen BS, Clausen C, Schmidt K, Vinggaard AM, Zimmermann H, Neubauer JC, Rasmussen MA. Human iPSC-derived hepatocytes in 2D and 3D suspension culture for cryopreservation and in vitro toxicity studies. Reproductive Toxicology. 2022. 10.1016/j.reprotox.2022.05.005
- Carpentier A, Nimgaonkar I, Chu V, et al. Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screening. Stem Cell Research. 2016. 10.1016/j.scr.2016.03.009
- Pettinato G, Ramanathan R, Fisher RA, et al. Scalable differentiation of human iPSCs in a multicellular spheroid-based 3D culture into hepatocyte-like cells through direct Wnt/β-catenin pathway inhibition. Scientific Reports. 2016. 10.1038/srep32888
- Bell CC, Dankers ACA, Lauschke VM, et al. Comparison of hepatic 2D sandwich cultures and 3D spheroids for long-term toxicity applications: a multicenter study. Toxicological Sciences. 2018. 10.1093/toxsci/kfx289
- Taylor MJ, Weegman BP, Baicu SC, et al. New approaches to cryopreservation of cells, tissues and organs. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 2019. 10.1159/000499453
转发语：原代肝细胞太贵且不稳定？这篇论文把iPSC肝细胞做成了可冻存、可384孔板高通量筛选的标准化模型，Nano-Glo报告基因让毒性检测灵敏度翻了10倍，工业级毒理筛选可以直接抄作业。
联系人：李东伟
📞 18045130660 🌐 https://www.biokingdom.top
📥 下载原文PDF：Reproductive Toxicology 2022 Human iPSC-derived hepatocytes