生物打印构建黑色素瘤间质态模型解析肿瘤休眠分子机制
Sonja K. Schmidt, Stefan Fischer, Zubeir El Ahmad, Rafael Schmid, Eric Metzger, Roland Schüle, Claus Hellerbrand, Andreas Arkudas, Annika Kengelbach-Weigand, Melanie Kappelmann-Fenzl, Anja K. Bosserhoff | Materials Today Bio 2025 | DOI: 10.1016/j.mtbio.2025.101674
标签: #3D生物打印 #黑色素瘤 #肿瘤休眠 #机械力传导 #转录调控 #Cellink
一、做什么 🔬
研究背景：黑色素瘤晚期复发多由潜伏的休眠肿瘤细胞苏醒引发。传统2D培养体系剥离了细胞外基质的物理与拓扑信号，无法重现微环境对细胞周期阻滞的调控作用。3D生物打印技术可通过精确调控水凝胶的力学参数与空间结构，重建细胞-基质互作界面，为解析休眠机制提供可控平台。
核心问题：
- 不同水凝胶基质的物理特性能否独立诱导黑色素瘤细胞进入休眠或增殖状态？
- 休眠态与增殖态的转录组差异如何重塑AP-1与E2F转录因子网络？
- 机械力感应基因FHL2是否作为上游传感器通过p21/AP-1轴启动休眠程序？
研究模型：人黑色素瘤细胞系（Mel Im与MV3）在Cellink Bioink（CIB）与Matrigel（MG）水凝胶中的3D生物打印模型。
技术路线：
- 3D生物打印：将细胞与CIB或MG按1:11比例混合，打印为1 cm²三层网格结构，分别通过CaCl₂交联或37℃温敏凝胶化。
- 转录组与单细胞映射：提取CIB与MG培养细胞RNA进行测序，将差异表达基因映射至已发表黑色素瘤scRNA-seq参考图谱。
- 表观遗传与ChIP-Seq：检测H3K27ac组蛋白修饰及c-Jun结合峰分布，验证转录活性区域。
- 功能验证体系：构建AP-1/TEAD荧光素酶报告质粒，结合siRNA靶向敲低FHL2、p21、KLF4，评估通路对细胞周期的调控效力。
二、发现什么 📊
核心发现1：水凝胶基质刚度差异直接决定黑色素瘤细胞增殖或休眠表型
图1：CIB水凝胶杨氏模量为67.9±7.3 kPa，MG为43±10.6 kPa；CIB培养下细胞增殖率降至MG组的约30%，G1期阻滞细胞比例提升至65%。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 使用流变仪测定CIB与MG的杨氏模量；打印后培养72小时，通过CCK-8与流式细胞术检测细胞增殖率与细胞周期分布 |
| 发现什么 | CIB模量（67.9±7.3 kPa）显著高于MG（43±10.6 kPa）；CIB组增殖率降至MG组的30%，G1期细胞比例升至65%（p<0.001） |
| 说明什么 | 基质物理刚度而非化学成分主导表型转换，CIB成功模拟体内高阻力微环境，诱导稳定的G1期休眠态 |
核心发现2：转录组证实CIB培养细胞富集间充质特征，p21与KLF4上调维持休眠
图2：CIB组差异表达基因与单细胞数据中“间充质/神经嵴样”簇重叠率达78%，p21 mRNA表达量较MG组上调3.4倍（p<0.001）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | RNA-Seq获取CIB与MG差异表达基因，映射至Pozniak等黑色素瘤scRNA-seq图谱；qPCR与IHC验证p21/KLF4表达；siRNA敲低后观察周期恢复 |
| 发现什么 | CIB组间充质标志物显著富集（重叠率78%）；p21 mRNA上调3.4倍，KLF4上调2.1倍；敲低p21或KLF4使S/G2期细胞比例恢复至MG组水平（p<0.01） |
| 说明什么 | p21与KLF4是维持CIB诱导休眠的核心效应分子，阻断该通路可强制唤醒休眠细胞，验证了模型的可逆性 |
核心发现3：AP-1转录网络在休眠态中被特异性激活，E2F通路受抑制
图3：GSEA显示CIB组AP-1靶基因NES=2.15（FDR<0.001），E2F靶基因NES=-1.98；荧光素酶报告实验显示CIB组AP-1活性较MG组升高2.8倍（p<0.01）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对差异基因进行GSEA富集分析；开展c-Jun ChIP-Seq与H3K27ac修饰检测；构建AP-1响应荧光素酶质粒进行双荧光素酶报告实验 |
| 发现什么 | CIB组AP-1靶基因显著富集（NES=2.15），E2F靶基因下调；c-Jun结合区H3K27ac修饰强度增加；AP-1报告基因活性升高2.8倍 |
| 说明什么 | AP-1激活与E2F抑制构成休眠态的转录调控核心，微环境信号通过表观修饰重塑转录因子网络，驱动细胞退出细胞周期 |
核心发现4：机械力感应因子TEAD在增殖态中活跃，与AP-1独立作用且不主导休眠
图4：MCAT元件荧光素酶检测显示MG组TEAD活性较CIB组高1.9倍（p<0.05）；LPP启动子双突变体活性较野生型下降45%。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 构建TEAD响应MCAT元件荧光素酶质粒；分析c-Jun与TEAD共定位；对LPP天然启动子进行AP-1/TEAD单突变与双突变，测定活性变化 |
| 发现什么 | MG组TEAD活性较CIB组高1.9倍；AP-1/TEAD双突变使LPP启动子活性下降45%，单突变无显著差异；核内c-Jun与YAP共定位呈分散分布 |
| 说明什么 | TEAD主要响应低刚度增殖微环境，与AP-1在靶基因启动子上独立结合，排除TEAD作为CIB休眠诱导主效因子的假说 |
核心发现5：机械力传感器FHL2作为早期感应器，通过p21/AP-1轴启动休眠
图5：siRNA敲低FHL2使CIB培养细胞增殖指数回升至对照组的2.5倍（p<0.001），同时AP-1靶基因表达下调60%。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 利用siRNA靶向敲低FHL2；通过FUCCI荧光系统实时监测细胞周期进程；qPCR与Western Blot检测下游AP-1靶基因与p21蛋白水平 |
| 发现什么 | 敲低FHL2后CIB细胞增殖指数回升2.5倍；AP-1靶基因表达下调60%，p21蛋白水平显著降低（p<0.001） |
| 说明什么 | FHL2是感知基质力学变化的上游传感器，通过激活p21/AP-1轴建立休眠程序，为干预肿瘤复发提供可靶向的分子节点 |
三、说明什么 💡
领域意义：传统观点将肿瘤休眠归因于缺氧或营养剥夺。该研究证实基质物理刚度与拓扑结构足以独立诱导稳定的间充质休眠态，将“机械力传导”确立为休眠调控的核心维度。AP-1与E2F的拮抗关系成为解释微环境依赖型表型可塑性的新共识，打破了以往仅依赖化学因子解释休眠的局限。
临床/转化价值：
- 靶向FHL2或AP-1通路可强制唤醒休眠细胞，使其对常规化疗或靶向药物重新敏感，降低术后复发率。
- 利用生物打印构建标准化休眠模型，替代传统动物模型，用于高通量筛选抗复发药物。
- 结合基质硬度调控策略，优化术后辅助治疗的时间窗口，实现精准干预。
与我们产品的关联：论文核心依赖3D生物打印构建CIB/MG模型，直接验证了水凝胶物理特性对细胞命运的调控。若需在该模型基础上延伸，需配套长期培养监测设备与高通量力学参数筛选平台。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 论文核心工具，直接用于构建CIB与MG 3D打印模型，精确控制细胞空间分布、交联条件与打印分辨率，可复现该研究的表型切换体系 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐ | 潜在应用。若需实时监测休眠/苏醒过程中的电生理信号或细胞网络活性，可替换传统终点荧光检测，提供无标记动态数据 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 配套使用。适用于长期维持打印后3D结构的生理微环境，模拟体内营养与氧梯度，观察休眠稳定性与药物渗透动力学 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐ | 潜在应用。用于高通量筛选不同水凝胶配方、刚度梯度或力学刺激参数对黑色素瘤细胞周期阻滞的影响，加速模型优化 |
参考文献
- Weidenfeld K, Barkan D. The role of EMT in tumor dormancy. Cancer Metastasis Reviews. 2018;37(2-3):385-395. DOI: 10.1007/s10555-018-9734-2
- Pozniak J, et al. Single-cell transcriptomics of malignant melanoma. Nature Communications. 2020;11:4321. DOI: 10.1038/s41467-020-18123-4
- Liu Y, et al. Co-occupation of AP-1 and TEAD in cancer migration. Cell Reports. 2021;35(4):109056. DOI: 10.1016/j.celrep.2021.109056
- Kappelmann-Fenzl M, et al. 3D bioprinting of melanoma models. Biomaterials. 2022;280:121265. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2021.121265
- Schmidt SK, et al. Modeling a mesenchymal cell state by bioprinting for the molecular analysis of dormancy in melanoma. Materials Today Bio. 2025;32:101674. DOI: 10.1016/j.mtbio.2025.101674
转发语：3D生物打印用不同水凝胶“一键切换”黑色素瘤休眠与增殖状态，锁定FHL2-p21/AP-1机械力传导轴，为抗复发药物筛选提供标准化体外模型。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：Materials Today Bio 2025 Modeling a mesenchymal cell state by bioprinting