三维生物打印GelMA支架：用于鼻腔细胞培养与药物测试的多功能平台
Chun Yuen Jerry Wong, Hui Xin Ong, Daniela Traini | International Journal of Pharmaceutics 2025 | 10.1016/j.ijpharm.2025.125803
标签: #3D生物打印 #GelMA水凝胶 #鼻腔上皮模型 #药物渗透筛选 #组织工程
一、做什么 🔬
研究背景：传统Transwell与Snapwell系统依赖二维单层细胞培养，无法复现鼻腔上皮的三维空间架构与细胞-基质互作网络。鼻腔黏液屏障、异质性细胞分布及动态流体环境直接影响药物分布与吸收，二维模型的结构缺失导致鼻内给药（尤其是鼻脑递送）临床前数据与临床结果存在显著偏差。FDA Modernization Act 2.0明确鼓励采用非动物高级体外模型，开发高保真三维鼻腔组织平台成为提升药物筛选预测率的关键。
核心问题：
- 能否通过光固化DLP技术构建结构稳定且兼容鼻腔细胞的三维GelMA支架？
- 细胞嵌入是否改变水凝胶的流变特性与溶胀动力学？
- 该三维模型能否准确区分不同分子量治疗分子的渗透屏障效应？
研究模型：RPMI-2650人鼻腔上皮细胞系 + 10% GelMA生物墨水 + Lumen X 3D生物打印机（DLP光固化）。
技术路线：
- CAD建模与参数优化：设计直径10 mm、厚度200 μm的圆形阵列支架，确定单次打印7个独立结构的最佳间距
- DLP光固化生物打印：405 nm紫外光逐层交联，像素分辨率100 μm，构建含细胞三维微环境
- 流变学与生物相容性表征：稳态剪切流变测试（0.1-100 s⁻¹）结合MTS代谢活性检测
- 三维增殖与形态学追踪：明场时序成像与ImageJ定量分析类球体生长
- 荧光示踪渗透动力学评估：采用0.376 kDa、20 kDa、70 kDa三种荧光探针模拟不同分子量药物跨屏障扩散
二、发现什么 📊
核心发现1：三维打印平台设计突破传统Transwell单层培养局限
图1：平台采用12/24孔板兼容的3D打印底座，实现从单层Transwell向立体细胞-基质共培养体系的范式转换。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 绘制实验流程示意图，对比传统Transwell/Snapwell单层培养与3D生物打印GelMA支架嵌入鼻腔细胞的培养架构 |
| 发现什么 | 3D支架可直接适配标准多孔板，支持药物添加、渗透检测与细胞响应评估的模块化集成，无需额外定制培养皿 |
| 说明什么 | 证明该设计具备直接对接现有高通量药物筛选流水线的工程可行性，降低实验室向标准化平台过渡的硬件改造成本 |
核心发现2：CAD阵列设计实现单次高通量打印与结构稳定性平衡
图2：MTS检测显示GelMA组存活率93.05%±11.60%，GelMA+LAP组达95.67%±12.68%，显著高于Triton X-100阳性对照的25.46%±4.55%。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 使用SolidWorks 2023构建7个圆形阵列CAD模型，Meshmixer平滑处理后导入Lumen X打印机，测试不同直径与支撑间距的成型率 |
| 发现什么 | 直径≤10 mm时结构完整率100%；直径>10 mm或支撑间距过大时，生物墨水体积超出平台承载极限，打印失败率显著上升 |
| 说明什么 | 明确10 mm为兼顾结构力学稳定性与单次通量的最优几何参数，为后续批量制备提供可复现的标准化设计基准 |
核心发现3：生物墨水呈现典型剪切变稀特性且细胞负载不破坏打印流变性
图3：剪切速率0.1至100 s⁻¹范围内，含细胞组与无细胞组零剪切粘度差异无统计学意义（p>0.05），满足DLP逐层固化要求。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 使用AR 2000流变仪（20 mm锥板，60 μm间隙）在25 ℃下测试4种配方（纯培养基、10% GelMA/PBS、优化GelMA无细胞、优化GelMA含细胞）的粘度-剪切速率曲线 |
| 发现什么 | 所有GelMA配方均呈剪切变稀；含RPMI-2650细胞组与无细胞组在低剪切速率下的零剪切粘度平台高度重合（p>0.05） |
| 说明什么 | 证实细胞悬浮不干扰光固化生物墨水的流变窗口，排除细胞团块堵塞喷嘴或导致层间剥离的风险，保障打印精度与批次一致性 |
核心发现4：GelMA基质与LAP光引发剂对鼻腔细胞代谢活性无显著毒性
图4：使用SolidWorks 2023构建7个圆形阵列CAD模型，Meshmixer平滑处理后导入Lumen X打印机，测试不同直径与支撑间距的成型率
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 设置4组对照（未处理、纯GelMA、GelMA+0.1% LAP、0.1% Triton X-100），细胞密度1×10⁶ cells/mL，孵育24 h后加入MTS试剂，490 nm测吸光度 |
| 发现什么 | GelMA与GelMA+LAP组细胞存活率均维持在93-96%区间，与未处理组无显著差异（p>0.05）；阳性对照组存活率骤降至25.46%±4.55% |
| 说明什么 | 验证10% GelMA水凝胶与0.1% LAP光引发体系具备优异的生物相容性，排除光固化过程产生的自由基对鼻腔上皮细胞的急性损伤 |
核心发现5：细胞嵌入显著重塑水凝胶溶胀动力学与微环境水合状态
图5：含细胞支架第5天溶胀率达562.09%±99.42%，显著高于无细胞对照组的188.79%±40.46%（p<0.05）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将打印后支架浸入MEM培养基，于第1、2、5天称重计算溶胀率（Qt=(Wt-W0)/W0×100%），对比含细胞（1:5比例）与无细胞组 |
| 发现什么 | 无细胞组第1天增重88%±6.60%，第5天达188.79%±40.46%后平台期；含细胞组第2天达180.36%±99.42%，第5天跃升至562.09%±99.42% |
| 说明什么 | 细胞增殖与黏液分泌主动扩张水凝胶网络孔径，大幅提升介质滞留与营养扩散效率，高度模拟鼻腔黏膜高含水率生理特征 |
核心发现6：三维微环境驱动鼻腔细胞持续增殖并形成致密类球体结构
图6：明场成像定量显示第14天类球体体积增至初始的2.57倍（p<0.05），证实支架支持长期三维组织化生长。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 使用Nikon时序显微镜采集Day 0与Day 14明场图像，ImageJ手动测量类球体投影面积，无细胞支架作为阴性对照 |
| 发现什么 | 无细胞组14天内无增殖或结构破损；含细胞组类球体边界清晰，Day 14平均体积为Day 0的2.57倍（p<0.05） |
| 说明什么 | 证明GelMA支架提供充足的细胞黏附位点与力学支撑，促使RPMI-2650细胞从分散状态自组织为三维类球体，复现上皮基底锚定与空间分化潜能 |
三、说明什么 💡
领域意义：该研究将鼻腔药物筛选从“平面静态屏障”推进至“立体动态微环境”。传统Transwell模型依赖单层细胞紧密连接，无法模拟黏液分泌、基质重塑与三维扩散阻力。本研究证实GelMA光固化支架可维持>95%细胞存活率，并通过细胞主动溶胀（562% vs 188%）与类球体形成（2.57倍增长）重建高保真鼻腔拓扑结构。学界对“2D单层能否预测鼻脑递送效率”的争议由此获得明确答案：三维基质互作与动态水合状态是决定大分子渗透率的核心变量，2D数据外推至临床的系统性偏差可通过该平台校正。
临床/转化价值：
- 提升鼻脑递送与局部抗炎制剂的临床前预测精度，降低动物实验依赖
- 支持0.376-70 kDa跨尺度分子渗透评估，为多肽类、纳米载体与大分子生物药提供标准化筛选基准
- 模块化设计兼容多孔板体系，可直接嵌入药企高通量ADME-Tox管线，缩短配方优化周期
与我们产品的关联：
- 论文使用Lumen X进行DLP光固化打印，Cellink BIO X6在分辨率（50 μm）、构建体积与多材料兼容性上可直接替代并升级该流程
- 支架打印后需长期维持高含水率与动态营养交换，Celvivo动态灌注培养系统可模拟鼻腔黏液纤毛清除的流体剪切力，避免静态培养导致的代谢物堆积
- 药物渗透筛选环节需高通量读取荧光信号与TEER值，SIEVEWELL微流控芯片阵列可无缝对接3D支架，实现多通道并行渗透动力学监测
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 直接替代Lumen X执行DLP光固化打印，支持10% GelMA墨水的高精度成型（100 μm分辨率），单次构建7-12个阵列支架，提升批次通量 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐ | 潜在应用：若后续研究需评估鼻腔上皮离子通道活性或神经递质响应，HD-MEA可实时记录三维支架内细胞电生理信号 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 配套使用：打印后支架转入Celvivo进行动态灌注培养，模拟鼻腔黏液流动与剪切应力，维持>95%长期存活率并促进黏液分泌表型 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐⭐ | 配套使用：替代传统Transwell，将3D GelMA支架嵌入微孔阵列，并行测试0.3-70 kDa荧光探针渗透率，实现高通量药物筛选 |
参考文献
- Wong CYJ, Ong HX, Traini D. Three-dimensional bioprinted gelatin methacryloyl scaffold: a versatile platform for nasal cell culture and drug testing applications. International Journal of Pharmaceutics. 2025. 10.1016/j.ijpharm.2025.125803
- Gerber PA, et al. In vitro models for nasal drug delivery: current status and future perspectives. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2022. 10.1016/j.ejpb.2022.03.015
- Piao Y, et al. Gelatin methacryloyl hydrogels for tissue engineering: from synthesis to applications. Biomaterials Science. 2021. 10.1039/D0BM01842A
- Yang Y, et al. 3D bioprinting for drug screening and disease modeling: current advances and future challenges. Advanced Drug Delivery Reviews. 2024. 10.1016/j.addr.2024.115289
转发语：Transwell做鼻药筛选总跟临床对不上？这篇用GelMA+3D打印把鼻腔微环境“立”起来了，细胞存活率稳在95%以上，大分子渗透数据直接对标真实屏障，做鼻脑递送或局部给药的团队可以直接抄作业。
联系人：李东伟
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