引导与非引导分化前脑类器官的多组学分析揭示细胞组成与代谢谱差异
Marie Sejberg Øhlenschlæger, Pia Jensen, Jesper Foged Havelund, Sissel Ida Schmidt, Fadumo Abdullahi Mohamed, Magdalena Sutcliffe, Sofie Blomberg Elmkvist, Lucrezia Criscuolo, Steven W. Wingett, Ilaria Chiaradia, Elif Bayram, Jeppe Allen Abildsten Nicolaisen, Lene Andrup Jakobsen, Jonathan Brewer, Michael Eriksen Benros, Kristine Freude, Nils Joakim Færgeman, Madeline A. Lancaster, Martin Røssel Larsen, Helle Bogetofte | Cell Reports Methods 2026 | DOI: 10.1016/j.crmeth.2025.101295
标签: #类器官培养 #多组学分析 #前脑发育 #代谢重编程 #精神分裂症模型 #高通量筛选
一、做什么 🔬
研究背景：人前脑类器官已成为解析神经发育与神经系统疾病的核心体外模型。当前主流构建策略分为两类：依赖外源生长因子与小分子诱导的“引导分化”，以及依赖干细胞自组织能力的“非引导分化”。两类方案在文献中并行使用，但缺乏系统性、无偏倚的多组学横向对比。模型选择差异是否导致细胞命运偏移与代谢基线改变，直接影响疾病表型建模的可靠性与可重复性。
核心问题：
- 引导与非引导分化策略在细胞类型组成上存在何种定量差异？
- 能量代谢途径重编程是如何随分化方案发生系统性偏移的？
- 疾病相关蛋白表型是否受类器官构建方法的直接干扰？
研究模型：人iPSC来源的前脑类器官（第20至120天），涵盖健康对照与精神分裂症临床来源iPSC系。
技术路线：
- 蛋白质组与翻译后修饰定量分析：检测7,082种蛋白及15,775条磷酸化肽段、663条唾液酸化N-糖肽段
- 靶向代谢组与脂质组学：定量300种代谢物与794种脂质分子
- 单细胞转录组测序（scRNA-seq）：捕获9,913个细胞进行UMAP聚类与拟时序轨迹推断
- 多电极阵列（MEA）电生理记录：连续监测第100至120天类器官网络放电活动
- 空间免疫荧光与Western Blot验证：定位关键神经/胶质标志物及线粒体/缺氧标志物
二、发现什么 📊
核心发现1：蛋白质组与翻译后修饰谱清晰区分两类分化路径，引导组富集神经元蛋白，非引导组富集代谢与胶质蛋白
图1：PCA完全分离两组样本，鉴定出757种差异蛋白，引导组FOXG1与突触蛋白上调，非引导组GFAP与S100B上调。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对第40天类器官进行大规模非修饰蛋白、磷酸化肽段与唾液酸化N-糖肽段定量分析（n=9，3次独立分化），采用秩积检验（q≤0.05，倍数变化±0.3）筛选差异分子 |
| 发现什么 | 共定量7,082种蛋白；757种蛋白显著差异；引导组FOXG1、突触结合蛋白1（SYN1）、神经分泌蛋白VGF显著上调；非引导组GFAP、S100B显著富集；GO分析显示引导组富集“树突发育”与“离子型谷氨酸受体活性”，非引导组富集“线粒体呼吸链组装”与“氧化磷酸化” |
| 说明什么 | 分化起始信号直接决定早期蛋白质组基线，非引导方案自发偏向胶质谱系与能量代谢相关蛋白表达，推翻“两种方案在分子层面高度一致”的假设 |
核心发现2：代谢组与脂质组呈现截然不同的能量底物偏好，非引导组依赖长链脂肪酸转运与膜结构重塑
图2：定量300种代谢物与794种脂质，非引导组己糖基神经酰胺、磷脂酰甘油与肉碱占比显著升高（q≤0.05），引导组油酰胺占比更高。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对第40天类器官进行非靶向代谢组与脂质组学检测（n=5，单次分化），采用层次聚类与秩积检验分析代谢物丰度差异 |
| 发现什么 | 35种脂质在引导组显著升高，68种在非引导组显著升高；非引导组己糖基神经酰胺、磷脂酰甘油、肉碱占总脂质比例显著增加（q≤0.05）；引导组油酰胺（属“其他”亚类）比例显著升高；糖酵解/磷酸戊糖途径代谢物在引导组显著富集 |
| 说明什么 | 细胞类型差异直接映射至脂质代谢网络，非引导组依赖长链脂肪酸转运与髓鞘相关脂质合成，引导组偏向神经递质前体与生物合成底物积累 |
核心发现3：引导组突触蛋白与神经递质水平显著升高，但后期网络电生理成熟度趋于一致
图3：第40与120天引导组SYN1与MAP2蛋白水平显著高于非引导组（p≤0.05），谷氨酸等4种神经递质显著增加，MEA记录显示两组平均放电频率无显著差异。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | Western Blot定量SYN1与MAP2（第40/120天），代谢组检测神经递质，第120天类器官接种于MEA芯片连续记录20天，统计平均放电频率、爆发间隔变异系数与网络爆发次数 |
| 发现什么 | 第40天与第120天引导组SYN1与MAP2蛋白水平均显著高于非引导组（p≤0.05）；谷氨酸、NAA等4种神经递质显著增加（p≤0.05）；MEA显示两组平均放电频率、爆发间隔CV、网络爆发数均无统计学差异（p>0.05） |
| 说明什么 | 引导方案加速神经元与突触结构形成，但整体网络电生理成熟度在后期趋于一致，提示结构丰度不直接等同于电活动强度，突触修剪或抑制性环路可能抵消兴奋性输入 |
核心发现4：非引导组保留更多放射状胶质细胞并促进星形胶质细胞分化，FOXG1呈现发育阶段特异性核质转位
图4：第80天非引导组GFAP+面积占比显著高于引导组（p≤0.05），第120天S100B显著升高，非引导组GFAP+细胞中FOXG1定位于胞质。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 免疫荧光与Western Blot检测第40、80、120天类器官中GFAP、S100B及FOXG1表达与亚细胞分布，定量GFAP+面积占DAPI+总面积比例 |
| 发现什么 | 第80天非引导组GFAP+面积占比显著高于引导组（p≤0.05）；第120天S100B蛋白水平显著升高（p≤0.01）；非引导组GFAP+细胞中FOXG1定位于胞质，引导组严格定位于细胞核；MAP2+神经元中未观察到FOXG1胞质定位 |
| 说明什么 | 非引导方案保留更多放射状胶质细胞并促进星形胶质细胞分化，FOXG1核质转位提示其处于向成熟胶质过渡的特定发育阶段，胶质谱系扩增可能受脉络丛旁分泌信号驱动 |
核心发现5：非引导组线粒体生物发生增强且高度依赖氧化磷酸化，代谢压力导致抗氧化储备消耗
图5：非引导组第40与120天TOMM20显著升高（p≤0.01），ATP生成速率显著更高（p≤0.05），NADH/NAD比值上升，还原型谷胱甘肽显著降低。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | Western Blot检测线粒体标志物TOMM20与溶酶体标志物LAMP1，Seahorse检测ATP生成速率，代谢组测定NADH/NAD与谷胱甘肽，Western检测HIF1α与缺氧对照 |
| 发现什么 | 非引导组第40与120天TOMM20显著升高（p≤0.01）；ATP生成速率显著更高（p≤0.05）；NADH/NAD比值升高，还原型谷胱甘肽显著降低（p≤0.05）；HIF1α在非引导组显著上调（p≤0.001），但糖酵解蛋白（HK2、MCT4）在引导组更高 |
| 说明什么 | 非引导组线粒体生物发生增强且高度依赖氧化磷酸化，代谢压力导致抗氧化储备消耗；HIF1α升高由体积增大与氧耗增加引起，非糖酵解偏移的主因，代谢重编程由细胞类型决定而非缺氧微环境 |
核心发现6：单细胞转录组揭示非引导组富集脉络丛与Cajal-Retzi细胞，引导组特异性出现中间神经元簇且糖酵解基因跨细胞类型上调
图6：scRNA-seq捕获9,913个细胞，非引导组LMX1A、TTR、RELN表达簇显著富集，引导组特异性检出DLX2、GAD2表达的中间神经元簇，HK2与PDK1在引导组所有细胞中普遍上调。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对第20与40天类器官进行scRNA-seq（共9,913个细胞，n=3/组），进行UMAP聚类、差异表达分析与拟时序轨迹推断，提取关键代谢基因表达分布 |
| 发现什么 | 非引导组LMX1A、TTR、RELN表达簇显著富集；引导组特异性检出DLX2、GAD2表达的mGE与中间神经元簇；HK2与PDK1转录本在引导组所有细胞类型中普遍上调；OXPHOS相关转录本（NDUFA4、UQCRB）在两组间差异较小，主要受细胞类型调控 |
| 说明什么 | 分化路径决定细胞命运图谱，非引导组偏向背侧/脉络丛谱系，引导组自发产生腹侧中间神经元；糖酵解基因上调是引导组跨细胞类型的固有代谢特征，非特定细胞亚群驱动 |
三、说明什么 💡
领域意义：该研究建立前脑类器官构建方案与多组学基线的直接映射关系。过去学界默认快速神经元化伴随氧化磷酸化升高，本研究通过蛋白质组、代谢组与单细胞转录组交叉验证，证明引导分化方案反而高度依赖糖酵解与磷酸戊糖途径，非引导方案因脉络丛与胶质细胞富集而呈现高OXPHOS与脂肪酸β-氧化特征。争议焦点从“哪种方案更接近体内”转向“代谢基线如何干扰下游表型解读”。
临床/转化价值：
- 精神分裂症iPSC建模显示，引导组检出JUN激酶通路异常与糖鞘脂相关蛋白下调，非引导组检出tRNA氨基酰化通路异常；单一模型无法覆盖全疾病谱系，需根据靶点通路选择构建策略
- 批次间变异分析提示非引导方案组内与批次间差异更大，高通量药物筛选需优先采用引导方案以降低背景噪声
- 代谢基线差异提示类器官培养液配方需针对分化策略定制，避免外源代谢物掩盖内源表型
与我们产品的关联：
- 3Brain HD-MEA / CorePlate：论文实际使用该平台记录第120天类器官电生理，验证结构差异不直接转化为放电频率差异，可直接复现该实验模块
- Cellink BIO X / BIO X6：引导方案依赖标准化外源因子梯度，BIO X6的微流控灌注与自动化培养可消除人工换液导致的代谢波动，降低批次间变异
- Celvivo：活体代谢动态监测可替代终点Seahorse检测，实时追踪OXPHOS/糖酵解切换时间点，缩短验证周期
- SIEVEWELL：微流控芯片适用于长期类器官培养与代谢物原位捕获，配合非靶向代谢组可解析脉络丛旁分泌信号对胶质分化的驱动机制
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐ | 引导分化方案标准化生成与高通量扩增，消除人工换液导致的代谢波动与批次差异 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 论文实际使用该芯片记录第120天类器官网络放电，可直接复现电生理验证模块 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 活体成像与代谢动态监测，替代终点Seahorse检测，实时追踪OXPHOS/糖酵解切换 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐ | 微流控长期培养与代谢物原位捕获，配合代谢组解析脉络丛旁分泌信号机制 |
参考文献
- Lancaster MA, et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 2013. DOI: 10.1038/nature12517
- Pasca AM, et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 2015. DOI: 10.1038/nmeth.3406
- Zhao Y, et al. Proteomic landscape of the developing human fetal frontal lobe. Cell Rep. 2021. DOI: 10.1016/j.celrep.2021.109678
- Øhlenschlæger MS, et al. Multi-omic analysis of guided and unguided forebrain organoids reveals differences in cellular composition and metabolic profiles. Cell Rep Methods. 2026. DOI: 10.1016/j.crmeth.2025.101295
转发语：同一批iPSC，用不同方案养出的前脑类器官，细胞组成和代谢底物完全不同。选错模型，疾病表型可能直接跑偏。这篇多组学横评给神经类器官研究划了条硬基线。
联系人：李东伟
📞 18045130660 🌐 https://www.biokingdom.top
📥 下载原文PDF：Cell Rep Methods 2026 前脑类器官多组学分析