引导与非引导前脑类器官的多组学分析揭示细胞组成与代谢特征差异
Marie Sejberg Øhlenschlæger, Pia Jensen, Jesper Foged Havelund, Sissel Ida Schmidt, Fadumo Abdullahi Mohamed, Magdalena Sutcliffe, Sofie Blomberg Elmkvist, Lucrezia Criscuolo, Steven W. Wingett, Ilaria Chiaradia, Elif Bayram, Jeppe Allen Abildsten Nicolaisen, Lene Andrup Jakobsen, Jonathan Brewer, Michael Eriksen Benros, Kristine Freude, Nils Joakim Færgeman, Madeline A. Lancaster, Martin Røssel Larsen, Helle Bogetofte | Cell Reports Methods 2026 | 10.1016/j.crmeth.2025.101295
标签: #脑类器官 #多组学分析 #神经发育 #代谢重编程 #疾病建模 #高通量筛选
一、做什么 🔬
研究背景：脑类器官已成为解析人类皮层发育与神经精神疾病机制的核心体外模型。当前主流构建路径分为依赖外源小分子与生长因子的“引导分化”与依赖干细胞自组织能力的“非引导分化”。尽管两类模型均被广泛采用，但学界对分化策略如何系统性重塑细胞谱系比例、基础能量代谢通路及疾病表型重现度缺乏定量对照，导致实验设计存在模型选择盲区。
核心问题：
- 引导与非引导分化策略如何定量影响前脑类器官的神经元与胶质细胞比例？
- 两种构建路径是否会导致类器官在氧化磷酸化与糖酵解依赖上产生根本性分歧？
- 模型选择差异是否会直接改变精神分裂症等疾病的蛋白质组学特征解析结果？
研究模型：人诱导多能干细胞（iPSC）衍生的前脑类器官（第20天至第120天），涵盖健康对照与精神分裂症患者来源细胞系。
技术路线：
- 大规模蛋白质组与翻译后修饰分析：定量第40天类器官中7,082种蛋白、15,775个磷酸化肽段及663个唾液酸化N-糖肽段。
- 代谢组与脂质组联用：同步检测300种代谢物与794种脂质分子，绘制能量底物与脂质类别分布图谱。
- 单细胞转录组测序（scRNA-seq）：对9,913个细胞进行降维聚类与拟时序轨迹推断，解析谱系分化节点。
- 多电极阵列（MEA）电生理记录：连续监测第100至120天类器官的自发放电频率、网络爆发及突触同步性。
二、发现什么 📊
核心发现1：蛋白质组与翻译后修饰图谱明确区分两类类器官的神经元与代谢蛋白表达基线
图1：主成分分析（PCA）基于757种差异蛋白、1,079个差异磷酸化肽段及44个差异糖肽段（q≤0.05，FC±0.3）将引导与非引导类器官完全分离。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对第40天引导与非引导类器官（各3次独立分化，n=9）进行非修饰蛋白、磷酸化肽段及唾液酸化N-糖肽段定量质谱分析，执行PCA与GO富集分析。 |
| 发现什么 | 引导类器官中FOXG1、突触结合蛋白1（SYN1）、神经分泌蛋白VGF显著上调；非引导类器官中胶质纤维酸性蛋白（GFAP）与S100B显著上调。GO分析显示引导组富集“树突发育”与“糖酵解过程”（q≤0.05），非引导组富集“线粒体呼吸链组装”与“脂肪酸β-氧化”（q≤0.05）。 |
| 说明什么 | 分化策略直接决定类器官的蛋白质组基线。引导法偏向突触发生与糖酵解代谢，非引导法偏向胶质谱系与线粒体氧化代谢，推翻“两种方法在分子层面等效”的默认假设。 |
核心发现2：代谢组与脂质组联用证实两类类器官存在截然不同的能量底物利用模式
图2：scRNA-seq聚类9,913个细胞识别12个亚群，引导类器官特异性富集内侧神经节隆起（mGE）与中间神经元（INs）簇，且HK2与PDK1转录本在引导组所有细胞类型中表达量普遍更高。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 提取第40天类器官（n=5/组）进行非靶向代谢组与脂质组检测，通过PCA与层级聚类分析300种代谢物与794种脂质分子的丰度差异。 |
| 发现什么 | 代谢物PCA完全分离两组。脂质组中35种脂质在引导组显著升高，68种在非引导组显著升高。非引导组己糖基神经酰胺、磷脂酰甘油与肉碱百分比显著高于引导组（p<0.05）；引导组油酰胺百分比显著更高（p<0.05）。 |
| 说明什么 | 脂质类别差异与蛋白质组代谢通路富集高度一致。肉碱升高直接印证非引导类器官依赖脂肪酸转运与β-氧化，油酰胺升高提示引导类器官存在更强的神经发生与突触可塑性微环境。 |
核心发现3：引导类器官在早期与晚期均维持更高的神经元与突触相关蛋白丰度
图3：Western blot定量显示第40天与第120天引导类器官中SYN1与MAP2蛋白表达量均显著高于非引导组（p≤0.05至p≤0.001），代谢组检出4/5种神经递质在引导组显著富集。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对第40天与第120天类器官进行SYN1与MAP2免疫印迹定量；代谢组检测谷氨酸等神经递质；第80天进行突触共定位（Syn1/2与Homer1）免疫荧光；第120天进行MEA电生理记录。 |
| 发现什么 | 第40天与第120天引导组SYN1与MAP2表达量均显著高于非引导组（p≤0.05~0.01）。引导组谷氨酸等4种神经递质丰度显著更高。第80天突触共定位面积无显著差异，第120天MEA平均放电频率与网络爆发次数无显著差异（p>0.05）。 |
| 说明什么 | 引导法在分子与代谢层面持续富集神经元标志物，但突触数量与整体网络放电活性在成熟期趋于收敛。提示早期神经元生成优势不直接转化为晚期电生理超常表现，需结合细胞类型特异性功能评估。 |
核心发现4：非引导类器官富含放射状胶质与星形胶质细胞且伴随FOXG1亚细胞定位改变
图4：免疫荧光与Western blot证实第80天非引导类器官中GFAP阳性面积占比显著更高（p≤0.01），第120天S100B表达量显著上调（p≤0.05），且GFAP+细胞中FOXG1呈胞质定位。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对第40、80、120天类器官进行GFAP、FOXG1与MAP2多通道免疫荧光成像，定量GFAP+面积占比；Western blot检测GFAP与S100B蛋白水平。 |
| 发现什么 | 第40天两组GFAP均稀疏；第80天非引导组GFAP+面积占比显著高于引导组（p≤0.01）；第120天非引导组GFAP与S100B蛋白水平显著更高（p≤0.05~0.01）。非引导组GFAP+细胞中FOXG1呈胞质共定位，引导组呈核定位。 |
| 说明什么 | 非引导法保留更多放射状胶质前体并加速向星形胶质分化。FOXG1核转胞质是胶质分化的关键标志，证实非引导路径偏向胶质谱系发育，为研究胶质-神经元互作提供天然模型。 |
核心发现5：非引导类器官线粒体含量更高且高度依赖氧化磷酸化与脂肪酸β-氧化
图5：第40天与第120天非引导类器官TOMM20蛋白水平显著升高（p≤0.05），第80天ATP生成速率显著更高（p≤0.05），NADH/NAD比值显著上升，而ROS清除能力与还原型谷胱甘肽显著降低（p≤0.05）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 检测TOMM20与HIF1α蛋白水平；Seahorse分析第80天类器官ATP生成速率；代谢组定量NADH/NAD比值与还原型谷胱甘肽；检测ROS清除能力与LAMP1糖基化水平。 |
| 发现什么 | 非引导组TOMM20在第40天与第120天均显著更高（p≤0.05）。ATP生成速率显著高于引导组（p≤0.05）。NADH/NAD比值显著升高，ROS清除能力与还原型谷胱甘肽显著降低（p≤0.05）。HIF1α在非引导组显著更高（p≤0.05），排除缺氧驱动糖酵解差异的可能。 |
| 说明什么 | 非引导类器官具备更高的线粒体生物发生与氧化代谢通量，伴随抗氧化储备下降。代谢表型差异由分化程序内在决定，而非培养摇床导致的氧合差异，提示药物毒性测试需严格匹配代谢基线。 |
核心发现6：单细胞转录组揭示引导类器官富集中间神经元谱系且糖酵解基因跨细胞类型普遍上调
图6：脂质类别差异与蛋白质组代谢通路富集高度一致。肉碱升高直接印证非引导类器官依赖脂肪酸转运与β-氧化，油酰胺升高提示引导类器官存在更强的神经发生与突触可塑性微环境。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对第20天与第40天类器官（n=3/组）进行scRNA-seq，执行UMAP降维、差异基因表达与拟时序轨迹分析，跨细胞类型比对HK2、PDK1、NDUFA4与UQCRB表达。 |
| 发现什么 | 引导组特异性检出mGE与迁移/成熟中间神经元簇（DLX2、GAD2高表达）；非引导组富集皮层半（CH）与脉络丛（ChP）簇（LMX1A、TTR高表达）。HK2与PDK1在引导组所有细胞类型中表达量普遍上调，而OXPHOS基因NDUFA4与UQCRB表达差异主要由细胞类型决定。 |
| 说明什么 | 细胞组成异质性是代谢差异的核心驱动力之一。引导法通过外源信号诱导腹侧化，稳定生成抑制性中间神经元；糖酵解基因的全局上调表明引导类器官整体处于高生物合成状态，支持突触与轴突快速延伸。 |
三、说明什么 💡
领域意义：该研究以多组学数据确立“分化策略决定类器官分子表型”的新共识。过去学界常将引导与非引导类器官视为可互换的发育模型，本研究证实两者在细胞谱系偏向（神经元/中间神经元 vs 放射状胶质/脉络丛）与基础代谢通路（糖酵解 vs 氧化磷酸化/脂肪酸β-氧化）上存在系统性分歧。代谢基线差异直接关联疾病表型解析，推动领域从“形态学相似”向“多组学功能匹配”转型。
临床/转化价值：
- 疾病建模需精准匹配病理机制：研究突触功能障碍、中间神经元发育异常或糖脂代谢紊乱（如精神分裂症）优先选用引导类器官；研究胶质增生、脉络丛屏障功能或线粒体能量代谢障碍优先选用非引导类器官。
- 药物筛选需校正代谢背景：同一化合物在两类类器官中可能因基础ATP生成与ROS清除能力差异呈现相反毒性或疗效，提示高通量筛选必须建立平行对照与代谢基线校正算法。
- 标准化培养协议需明确记录：摇床转速、静态/动态切换时间点与外源因子浓度将直接改变代谢表型，推动建立类器官培养SOP与质控指标库。
与我们产品的关联：
- 类器官电生理与代谢表型验证高度依赖多电极阵列与高通量培养系统。3Brain CorePlate可直接替代MEA芯片用于长期网络放电记录与药物干预；Cellink BIO X6可实现标准化微环境控制，降低批次间形态与代谢波动；SIEVEWELL适用于多组学样本的高通量自动化制备与换液，保障蛋白质组/代谢组数据稳定性。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐ | 提供标准化3D打印与微环境控制，可精确调控生长因子梯度，降低非引导类器官的批次间形态变异，提升多组学数据重现性。 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 论文实际使用MEA记录电生理。CorePlate可直接用于类器官长期自发放电监测、网络爆发分析及突触药物筛选，替代传统MEA芯片。 |
| Celvivo | ⭐⭐ | 活细胞成像与微环境动态监测，适用于追踪类器官代谢重编程过程中的线粒体形态变化与ROS动态，需客户自建荧光探针体系。 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐⭐ | 高通量类器官培养与自动化换液系统，适用于多组学样本（蛋白/代谢/脂质）的标准化制备，减少人工操作引入的代谢扰动。 |
参考文献
- Lancaster MA, et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 2013. 10.1038/nature12517
- Pasca AM, et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 2015. 10.1038/nmeth.3407
- Zhao Y, et al. Proteomic analysis of human fetal frontal lobe development. Cell. 2020. 10.1016/j.cell.2020.05.015
- Øhlenschlæger MS, et al. Multi-omic analysis of guided and unguided forebrain organoids reveals differences in cellular composition and metabolic profiles. Cell Reports Methods. 2026. 10.1016/j.crmeth.2025.101295
转发语：引导和非引导脑类器官到底差在哪？这篇多组学研究把细胞组成和代谢底线的账算清楚了，做神经疾病建模选模型前建议先看这篇。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：Cell Reports Methods 2026 Multi-omic analysis of guided and unguided forebrain organoids