双光子活体成像揭示双氢青蒿素通过调控铁稳态发挥抗癫痫作用
Chenwen Shao, Yani Liu, Zhangpeng Chen, Yajuan Qin, Xueao Wang, Xueting Wang, Chao Yan, Hai-Liang Zhu, Jing Zhao, Yong Qian | Cell Chemical Biology 2022 | 10.1016/j.chembiol.2021.12.006
标签: #双光子成像 #铁稳态 #癫痫 #铁死亡 #高通量筛选 #活体脑成像
一、做什么 🔬
研究背景：铁代谢失衡与癫痫等神经系统疾病进展高度相关，但活体脑内活性亚铁离子（Fe2+）的时空分布缺乏直接成像证据。传统荧光探针难以穿透血脑屏障，无法在癫痫发作期动态追踪Fe2+通量变化，导致铁超载与神经元损伤的因果链条长期停留在离体组织层面。
核心问题：
- 能否开发一种高效穿透血脑屏障的近红外双光子荧光探针，用于活体脑内Fe2+的三维动态成像？
- 癫痫发作过程中脑内Fe2+水平呈现何种时空演变规律？
- 能否基于该探针建立高通量筛选平台，发现调控铁稳态的潜在抗癫痫化合物？
研究模型：KA诱导与PTZ点燃小鼠癫痫模型、原代海马神经元、SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系。
技术路线：
- FeP探针设计与合成：基于二氰基异佛尔酮骨架与N-氧化物策略构建近红外双光子探针
- 体外光谱与细胞学验证：测定线性响应范围、检测限、光稳定性及PAMPA-BBB血脑屏障通透性
- 高通量药物筛选：结合高内涵成像与流式细胞术筛选天然产物库，锁定铁稳态调控分子
- 活体双光子三维成像：利用Zeiss LSM 880 NLO对癫痫小鼠脑内Fe2+进行实时动态追踪
- 电生理与行为学验证：通过视频脑电-肌电（EEG-EMG）记录与Racine分级评估抗癫痫疗效
二、发现什么 📊
核心发现1：FeP探针具备优异的Fe2+特异性识别与双光子成像性能
图1：探针在0-50 μM Fe2+浓度范围内荧光强度呈线性上升（R²=0.9953），检测限低至14.2 nM，300秒内达到荧光饱和，双光子吸收截面峰值位于880 nm。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 体外光谱滴定、HPLC反应机制追踪、pH 3-12稳定性测试、SH-SY5Y细胞MTT毒性评估、双光子吸收截面（δ2）扫描 |
| 发现什么 | 456 nm激发下640 nm发射峰随Fe2+浓度线性增强，pH 7.4生理环境下响应稳定，100 μM浓度下细胞存活率>95%（p<0.001），880 nm激发时δ2值达最大 |
| 说明什么 | FeP具备高灵敏度、宽pH适应性与低光毒性，880 nm激发波长完美匹配近红外双光子成像组织穿透窗口，满足活体深层脑组织实时成像需求 |
核心发现2：基于FeP的高内涵筛选平台锁定双氢青蒿素为铁稳态调控先导物
图2：在KA应激的SH-SY5Y细胞中，DHA处理组FeP荧光强度较模型组下降约65%，PAMPA-BBB体外渗透率比值达到阳性对照卡马西平的0.82倍。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 构建KA诱导神经元应激模型，利用高内涵分析与流式细胞术筛选天然产物库，PAMPA-BBB体外血脑屏障渗透实验，原代海马神经元验证 |
| 发现什么 | DHA使细胞内Fe2+荧光信号显著下调（p<0.001），体外BBB渗透率优于槲皮素与布洛芬，在原代神经元中下调Fe2+效果显著优于其他青蒿素衍生物（p<0.05） |
| 说明什么 | DHA具备优异的脑靶向递送潜力，能特异性逆转病理状态下的铁超载，排除化合物自身荧光干扰后确认为铁稳态调控候选分子 |
核心发现3：DHA通过抑制铁死亡与恢复线粒体功能保护海马神经元
图3：DHA共处理使C11-BODIPY脂质过氧化信号降低42%（p<0.001），线粒体膜电位（JC-1红/绿比值）恢复至对照组的88%，基础耗氧率（OCR）提升1.9倍。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 双光子活细胞成像、C11-BODIPY脂质过氧化检测、JC-1膜电位流式分析、Seahorse XFe96细胞能量代谢测定、钙离子成像与突触长度定量 |
| 发现什么 | DHA显著降低脂质ROS积累，恢复线粒体呼吸链功能，抑制异常钙内流，突触长度延长35%（p<0.01），GPX4蛋白表达上调2.1倍（p<0.001） |
| 说明什么 | DHA并非单纯螯合铁离子，而是通过上调抗氧化防御系统（GPX4/GSH）与维持线粒体呼吸，阻断铁死亡级联反应，实现神经元结构与功能双重保护 |
核心发现4：活体组织切片与三维层扫证实DHA逆转癫痫脑结构损伤与铁沉积
图4：癫痫小鼠海马DG区星形胶质细胞（GFAP+）数量增加2.4倍（p<0.01），DHA干预后降至对照组的1.3倍；80 μm深度三维层扫显示病灶区FeP荧光强度较健侧高3.1倍。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 透射电镜观察突触与线粒体超微结构、免疫荧光定量神经/胶质细胞、脑组织冰冻切片80 μm深度Z-stack三维双光子成像 |
| 发现什么 | KA组线粒体嵴断裂、突触丢失，DHA组结构完整；病灶区Fe2+荧光呈颗粒状聚集，DHA处理后荧光信号均匀减弱，神经元数量回升（p<0.01） |
| 说明什么 | 病理状态下Fe2+异常富集伴随神经胶质增生与突触退化，DHA的神经保护作用与局部铁稳态恢复高度同步，证实铁沉积是癫痫微环境恶化的核心驱动因素 |
核心发现5：活体三维双光子实时成像动态追踪癫痫脑内Fe2+通量演变
图5：KA诱导后60分钟内活体脑内FeP荧光强度峰值达对照组的4.7倍（p<0.001），DHA预处理组荧光强度在30分钟时即下降至峰值的38%。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 小鼠颅窗植入手术，Zeiss LSM 880 NLO双光子显微镜880 nm激发，连续60分钟活体三维动态成像，DHA预防与干预组对比 |
| 发现什么 | 正常脑荧光微弱，癫痫发作期Fe2+信号快速攀升并维持高位，DHA干预组荧光上升斜率降低62%，峰值显著压低（p<0.001） |
| 说明什么 | 活体成像直接证实癫痫发作伴随Fe2+爆发性释放，DHA能在病理早期有效缓冲铁离子通量，为抗癫痫药物的实时药效评估提供可视化窗口 |
核心发现6：脑电与行为学验证DHA抗癫痫疗效及LCN2/FPN通路调控机制
图6：DHA干预使癫痫发作持续时间缩短58%（p<0.001），EEG总功率下降64%，脑组织LCN2 mRNA表达下调2.8倍，FPN蛋白表达上调1.7倍。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 视频脑电-肌电同步记录、Racine行为学分级、海马脑片局部场电位记录、RT-qPCR与Western Blot检测铁转运蛋白 |
| 发现什么 | DHA显著压低EEG异常放电振幅与线长度，Racine评分降低2个等级（p<0.01），下调促铁死亡因子LCN2，上调铁外排蛋白FPN（p<0.001） |
| 说明什么 | DHA通过重塑脑内铁转运网络（抑制LCN2毒性分泌/促进FPN外排）实现抗癫痫作用，为老药新用提供直接电生理证据与分子靶点支撑 |
三、说明什么 💡
领域意义：传统观点将癫痫脑内铁超载视为继发性损伤，缺乏活体动态证据支撑。该研究首次利用穿透血脑屏障的双光子探针，在活体层面直接证实癫痫发作伴随Fe2+爆发性累积，并将铁死亡机制与癫痫病理直接挂钩。学界对“铁螯合剂能否作为抗癫痫策略”存在争议，该工作通过DHA的靶向调控证明：精准干预铁稳态而非盲目螯合，是更可行的干预路径，推动铁代谢成像从离体走向活体。
临床/转化价值：
- 为抗癫痫药物开发提供基于铁稳态的高通量筛选新范式，缩短先导化合物发现周期
- 双氢青蒿素作为已上市抗疟药物，具备快速推进抗癫痫适应症临床转化的安全性基础
- 活体Fe2+成像技术可作为神经退行性疾病（帕金森、阿尔茨海默病）早期生物标志物检测与药效评估工具
与我们产品的关联：活体双光子成像依赖高灵敏度共聚焦/双光子系统；高通量筛选依赖高内涵成像平台；线粒体功能与能量代谢评估依赖细胞代谢分析仪；脑电记录依赖多通道电生理系统。若需将此类机制验证从动物模型下沉至体外高通量平台，需引入高时空分辨率的神经元网络记录设备与稳定的活体成像环境控制系统。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐ | 论文使用传统细胞培养与动物模型。若需构建3D脑类器官模拟癫痫微环境或进行高通量药物渗透测试，可引入生物打印技术建立更接近生理屏障的体外模型 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐⭐⭐ | 论文依赖传统EEG与海马脑片LFP记录。HD-MEA可直接在体外原代神经元网络层面实现高通量、高时空分辨率的癫痫样放电同步记录，加速DHA等候选物的机制验证与剂量筛选 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 活体双光子成像需稳定颅窗与麻醉维持。Celvivo活体成像舱可提供恒温恒湿与气体麻醉环境，有效抑制呼吸与运动伪影，提升长时间三维动态成像的数据稳定性与重复性 |
| SIEVEWELL | ⭐ | 论文未涉及微流控或器官芯片。若后续开展血脑屏障体外渗透模型的高通量筛选或脑脊液-血液交换动力学研究，可考虑微流控芯片替代传统Transwell以提升通量与剪切力模拟精度 |
参考文献
- Dixon, S.J., et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 2012. DOI: 10.1016/j.cell.2012.05.031
- Aron, A.T., et al. A bioluminescent probe for in vivo imaging of ferrous iron. Nat Chem Biol. 2017. DOI: 10.1038/nchembio.2378
- Ye, Q., et al. Ferrostatin-1 prevents kainic acid-induced seizures and ferroptosis in mice. Neurochem Int. 2020. DOI: 10.1016/j.neuint.2020.104812
- Andreini, C., et al. The human iron-proteome. Metallomics. 2018. DOI: 10.1039/c8mt00138g
转发语：活体双光子成像首次“看见”癫痫脑内亚铁离子爆发，老药双氢青蒿素通过调控铁稳态抑制铁死亡，为抗癫痫治疗提供全新靶点与筛选平台。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：Cell Chemical Biology 2022 3D two-photon brain imaging