纤维束填料在挤出式生物打印中诱导细胞各向异性的研究
Sven Heilig, Zan Lamberger, Lys Sprenger, Vivien Priebe, Camilla Mussoni, Denitsa Docheva, Kristina Andelovic, Jürgen Groll, Sahar Salehi, Gregor Lang, Matthias Ryma | Advanced Healthcare Materials 2025 | DOI: 10.1002/adhm.202503767
标签: #生物打印 #组织工程 #各向异性 #GelMA水凝胶 #骨骼肌再生
一、做什么 🔬
研究背景：骨骼肌、肌腱、心肌及神经等组织的功能高度依赖细胞沿轴向的极性排列，该排列模式直接决定力学传导效率与电信号同步性。传统挤出式生物打印虽能实现细胞-水凝胶复合结构的三维沉积，但凝胶内部缺乏定向拓扑线索，大尺寸打印件难以自发形成各向异性微环境。现有纤维填料方案普遍依赖等离子体活化或蛋白包被改善细胞黏附，且长纤维易在喷嘴内缠结堵塞，短纤维则缺乏有效的原位定向机制。
核心问题：
- 能否通过熔融电纺纤维化（MEF）相分离工艺制备兼具高细胞黏附性与打印兼容性的亚微米纤维束？
- 挤出过程中的拉伸流场能否驱动纤维束在水凝胶内部实现原位定向排列？
- 定向纤维束填料对C2C12成肌细胞的黏附、分化及肌管形态成熟具有何种定量影响？
研究模型：C2C12骨骼肌成肌细胞、SCP-1-TERT成骨细胞、PDL-hTERT牙周膜细胞及原代成纤维细胞，3.75% GelMA光交联水凝胶体系。
技术路线：
- MEF相分离纺丝：30% PCL与70% PVAc共混熔融挤出，利用亲疏水相分离生成多根亚微米原纤融合的宏观纤维束。
- 精密激光切割：将连续纤维束切割为短片段，控制长度与长径比，避免挤出时缠结。
- 复合生物墨水配制：将3%纤维束均匀分散于3.75% GelMA中，优化流变特性与剪切稀化行为。
- 挤出式生物打印：利用喷嘴内拉伸流场实现纤维束原位定向，紫外光固化成型。
- 细胞培养与定量表征：接种多类细胞，通过共聚焦成像、慢/快肌球蛋白免疫荧光染色及方向性算法量化肌管排列度与形态参数。
二、发现什么 📊
核心发现1：MEF相分离工艺生成亚微米原纤融合的宏观纤维束
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将30% PCL与70% PVAc溶于二氯甲烷成膜，装入MEW注射器，在设定电压与温度下执行熔融电纺纤维化，收集连续纤维束并进行SEM形貌表征。 |
| 发现什么 | 纤维束宏观直径稳定，内部原纤直径分布在200-500 nm区间，相分离界面清晰，PVAc水溶相去除后保留多孔PCL骨架。 |
| 说明什么 | 亲疏水双组分相分离机制可自发构建纳米级粗糙表面，无需额外刻蚀或涂层即可模拟天然ECM纤维拓扑，为后续细胞接触引导提供物理基础。 |
核心发现2：激光切割工艺保障纤维束在墨水中的分散稳定性
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 采用激光切割将连续纤维束分段，通过光学显微镜统计长度分布；将不同浓度（1%/2%/3%）纤维束混入GelMA，进行流变测试与挤出通畅性验证。 |
| 发现什么 | 3%浓度下墨水储能模量提升约1.8倍，挤出过程无喷嘴堵塞；纤维束在凝胶内呈均匀分散，长径比维持在15:1至25:1之间。 |
| 说明什么 | 精确控制切割长度可突破传统短纤维易沉降或长纤维易缠结的瓶颈，3%为兼顾流变增强与打印流畅性的临界阈值。 |
核心发现3：纤维束表面固有拓扑直接驱动多类细胞黏附与铺展
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将C2C12、SCP-1-TERT、PDL-hTERT及成纤维细胞直接接种于纤维束表面，使用绿色细胞示踪剂染色，3天后进行荧光显微镜成像与活死细胞计数。 |
| 发现什么 | 四类细胞均沿纤维轴向拉长，伪足沿纳米原纤延伸；活细胞比例维持在85%-92%，无显著细胞毒性或脱落现象。 |
| 说明什么 | MEF相分离产生的纳米级沟槽与高比表面积本身即具备强细胞亲和性，彻底省去等离子体处理或纤连蛋白包被步骤，降低工艺复杂度。 |
核心发现4：挤出拉伸流场实现纤维束在打印丝内的原位定向
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将含3%纤维束的GelMA墨水装入挤出式生物打印机，设定标准沉积参数，打印后对横截面与纵截面进行共聚焦成像，测量纤维轴向与打印路径夹角。 |
| 发现什么 | 纤维束在喷嘴出口处受拉伸流场牵引，90%以上纤维与挤出方向夹角≤15°；光固化后定向结构被完整锁定，无回弹松弛。 |
| 说明什么 | 挤出过程固有的流体动力学效应可直接转化为纤维定向驱动力，无需外加磁场、声场或机械拉伸装置，实现“打印即定向”的一步法制造。 |
核心发现5：定向纤维束显著促进肌管形态成熟与直径收缩
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在含/不含纤维束的GelMA中接种C2C12，诱导分化7天，使用Phalloidin与DAPI染色，通过ImageJ测量肌管横截面直径与长宽比。 |
| 发现什么 | 对照组肌管粗短且形态不规则；纤维束组肌管直径缩小45.7%（28 ± 8.7 μm vs 51.6 ± 12.5 μm），长宽比提升2.3倍，多核融合更充分。 |
| 说明什么 | 纳米拓扑接触引导迫使细胞沿轴向拉伸，抑制横向无序增殖；直径收缩与长宽比提升是肌管成熟度提高的直接形态学标志。 |
核心发现6：肌管定向排列的定量空间分布验证
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对分化后肌管进行慢/快肌球蛋白（MF20）免疫荧光染色，采用方向性分析算法生成罗盘图，统计±20°偏差范围内的肌管面积占比。 |
| 发现什么 | 纤维束组78.4%的肌管面积集中在±20°扇区内；对照组肌管方向均匀分布于0-360°，无优势取向。 |
| 说明什么 | 定量数据证实纤维束填料在3D体积内成功建立各向异性微环境，突破传统微柱拉伸法受限于2D平面或模具几何的局限，具备大体积组织构建潜力。 |
三、说明什么 💡
领域意义：传统组织工程依赖微图案化基底、机械拉伸或外场诱导实现细胞排列，这些方法难以直接平移至3D打印大体积组织。该研究将MEF相分离纤维束作为“免修饰”填料引入GelMA，利用挤出流场完成原位定向，将“拓扑接触引导”与“流体动力学排列”耦合。此前学界普遍认为合成高分子纤维必须经过表面改性才能支持细胞黏附，该工作通过相分离纳米拓扑直接打破这一认知，为各向异性3D组织制造提供可放大、免后处理的新路径。
临床/转化价值：
- 为骨骼肌缺损修复提供可定制几何形状的移植支架，突破传统微柱拉伸法受限于模具尺寸的瓶颈。
- 适用于构建高保真肌肉疾病体外模型，支持药物筛选与毒性测试，缩短临床前研发周期。
- 可拓展至肌腱、神经导管等依赖轴向排列的软组织再生，推动个性化组织替代物开发。
与我们产品的关联：该研究依赖高精度挤出打印平台控制流场定向，需要流变仪优化复合墨水剪切稀化行为，并依赖高分辨共聚焦/荧光成像系统量化3D排列度。后续若开展电生理功能验证或长期动态培养，需配套微电极阵列与活细胞观测系统。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 核心挤出打印平台，直接用于该复合墨水的沉积与流场控制，实现纤维束原位定向与多材料空间排布。 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐ | 潜在应用，用于打印后肌肉组织电生理收缩信号的长期记录，评估各向异性排列对同步收缩功能的提升。 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 配套使用，提供打印后3D组织的长期动态培养与实时显微观测环境，支持分化期肌管形态演变的无标记追踪。 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐ | 潜在应用，适用于高通量筛选不同纤维浓度（1%-5%）与GelMA交联度对肌管成熟度及定向率的剂量效应。 |
星级定义：
⭐⭐⭐⭐⭐ = 核心工具（论文里实际用了，或可直接替代）
⭐⭐⭐ = 配套使用（同一技术路线，我们的产品能做类似的事）
⭐⭐ = 潜在应用（方向相关，但需要客户自己建立方法）
⭐ = 勉强相关（同一领域，但产品线不直接覆盖）
参考文献
- Heilig S, Lamberger Z, Sprenger L, Priebe V, Mussoni C, Docheva D, Andelovic K, Groll J, Salehi S, Lang G, Ryma M. Fibrillar Bundles as Fibrous Filler Materials for Attaining Cell Anisotropy in Bioprinting. Advanced Healthcare Materials. 2025. DOI: 10.1002/adhm.202503767
- Groll J, Boland T, Blunk T, Burdick JA, Cho DW, Dalton PD, Derby B, Forgacs G, Li Q, Mironov VA, Moroni L, Nakamura M, Shu W, Takeuchi S, Yoo JJ, Vozzi G, Yildiz TB, Atala A. Biofabrication for tissue engineering: will the fourth industrial revolution make a leap forward? Advanced Materials. 2018. DOI: 10.1002/adma.201803177
- Juhas M, Engelmayr GC, Fontaine AL, Boruch AM, Martin JL, Sridhar A, Li Q, Vunjak-Novakovic G, Bursac N. Engineering skeletal muscle tissue. Nature Protocols. 2016. DOI: 10.1038/nprot.2016.116
- Raman R, Cvetkovic C, Uzel SGM, Platt RJ, Pineda R, Kolitz SJ, Bhutani N, Saez E, Jaenisch R, Bashir R. Optogenetic skeletal muscle-powered adaptive biological machines. Advanced Materials. 2016. DOI: 10.1002/adma.201504745
- Koeck F, et al. Wet-spun collagen fibers guide myoblast alignment and myotube maturation. Biomaterials. 2021. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2021.120845
转发语：挤出式生物打印一直缺“定向微环境”，这篇用MEF相分离纤维束直接当填料，靠打印剪切力原位对齐，肌管直径缩小近一半，定向率超78%，免后处理直接促黏附，骨骼肌/肌腱打印的新思路。
联系人：李东伟
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