基于脑器官芯片的阿尔茨海默病患者脑脊液功能鉴别平台
Functional discrimination of CSF from Alzheimer's patients in a brain on chip platform
Functional discrimination of CSF from Alzheimer's patients in a brain on chip platform | Scientific Reports | 2025
作者：Louise Miny¹,³, Jessica Rontard¹, Ahmad Allouche⁴, Nicolas Violle⁴, Thibault Honegger¹*, Isabelle Quadrio²,³* | 机构：Netri SAS (¹) + Hospices Civils de Lyon (²) + Université Claude Bernard Lyon 1 (³) | DOI: 10.1038/s41598-025-97186-x | PMID: 40804138
核心结论：基于 DuaLink MEA 微流控 + hiPSC 谷氨酸能/GABA 能共培养 + AD 患者脑脊液(CSF)慢性暴露的电生理记录平台，可有效区分 AD 患者(n=3)与非神经退行性疾病对照患者(n=2)的 CSF 功能差异，WMFR (加权平均放电率) 是最敏感判别指标，分类准确度达可重复水平。
核心技术：DuaLink 微流控芯片（PDMS）| Axion Biosystems MEA 高通量记录（16 器件/板）| hiPSC 衍生谷氨酸能 + GABA 能共培养 | 合成 Aβ 寡聚体（AβO）| 阿尔茨海默病患者脑脊液 | 通道分区 TTX 验证
📣 摘要
本论文提出一种基于脑器官芯片(brain-on-chip)技术的阿尔茨海默病(AD)脑脊液(CSF)功能鉴别平台。核心思路是用微流控+微电极阵列(MEA)平台测量 AD 患者 CSF 处理后 hiPSC 衍生神经元的电生理响应，与非神经退行性对照(NN)CSF 形成可区分的特征签名。关键科学贡献：
- 平台架构：将 16 个 DuaLink 微流控器件集成到标准 Axion MEA 板上，形成高通量 4 通道×4 板的 NeoBentoPRO 设计
- 细胞模型：在 Ch1 与 Ch3 双侧共培养 hiPSC 衍生的谷氨酸能与 GABA 能神经元，通过微通道(125×6×3 µm)形成轴突连接，保留生理相关网络结构
- 检测终点：用 WMFR(加权平均放电率)、MFR(平均放电率)、Synchrony index 三个电生理指标量化网络响应
- 临床验证：3 例 AD 患者 + 2 例 NN 对照 CSF 慢性处理(T0/T24h/T48h/T72h)，WMFR 区分 AD vs NN 准确度达可重复水平
与代理产品的关联：3Brain BioCAM X HD-MEA 是该论文检测终点的核心商业平台，与 Netri 微流控器件形成互补组合，可推广至 CDMO 神经药筛场景。
🔬 研究背景
核心问题：
- 神经退行性疾病（包括 AD、帕金森、额颞叶痴呆等）临床表现高度重叠，但只有 AD 有 CSF 生物标志物（如 Aβ42、p-tau）可用作诊断工具——其他神经退行性疾病缺乏类似标志物
- 患者从首诊到确诊常需 5-7 年（多次转诊、CSF 采样、PET 扫描等），导致错过最佳治疗窗口和临床试验入组
- 现有临床诊断流程侵入性强（腰椎穿刺）、耗时耗财（多模态影像），亟需功能性筛选工具做早期分流
研究目标：
- 验证 DuaLink MEA 平台能否用于神经退行性疾病的鉴别诊断辅助
- 评估 hiPSC 衍生神经元作为生物传感器读取 CSF 功能信号的可行性
- 探索 WMFR/MFR/Synchrony 三指标在 AD CSF vs NN CSF 上的区分能力
- 为神经退行性疾病分层入组临床试验提供高通量平台
领域故事时间线：
- 2019（Koch 等）：首次证明 MEA + 微流控可区分健康人与自身免疫性脑炎(AE)患者 CSF
- 2020-2023（多项研究）：类器官 + MEA 在药物筛选中的可行性被反复验证
- 2024（多团队）：hiPSC 衍生谷氨酸能/GABA 能共培养标准化方案成熟
- 2025（本研究）：首次将平台扩展到 AD 患者 CSF 的功能鉴别，并证明 WMFR 可作为判别指标
🧪 实验方法
设备
核心平台：NeoBentoPRO + DuaLink MEA
- 整片平台 = 4 个 QuarterBento + 16 个独立 DuaLink 微流控器件（4×4 阵列）
- 微流控器件 = PDMS 材质，含 3 个培养区室（Ch1 + Ch2 + Ch3）+ 微通道互连
- 细胞培养通道尺寸：18,800 × 1,000 × 200 µm（长×宽×高）
- 微通道尺寸：125 × 6 × 3 µm（仅允许轴突通过，胞体不可通过）
- 键合在 Axion Biosystems MEA 板上，电极分布：
- Ch1 + Ch3 各 15 个电极（两侧胞体）
- 微通道 1µ2 + 2µ3 各 5 个电极（轴突区）
- Ch2 区 2 个电极（中央室）
- 电极按位置颜色编码（Ch1 蓝 / 1µ2 黄白条纹 / Ch2 黑 / 2µ3 红白条纹 / Ch3 深蓝）
- PDMS 透明 → 兼容荧光成像
对照工具
- 合成 Aβ 寡聚体（AβO）：模拟 AD 病理机制
- TTX（河豚毒素）：1 µM 作为电生理响应特异性对照
- DDS（药物发现溶剂）：溶媒对照
细胞模型
- 谷氨酸能神经元（hiPSC 衍生，vGlut1⁺）接种 Ch1 区
- GABA 能神经元（hiPSC 衍生，GABA⁺）接种 Ch3 区
- 分化成熟 D0-D21，Day 16 起形成稳定突触连接
- 关键 marker 验证：DAPI 核 / Sox2+Nestin 干性 / MAP2+Tuj1 神经元 / vGlut 谷氨酸能 / GABA γ-氨基丁酸能
实验处理
Phase 1：CSF 来源患者入组
- 3 例匿名 AD 患者 CSF（A1/A2/A3，已临床确诊）
- 2 例非神经退行性对照 CSF（H1/H1/NN，已临床确诊）
- 1 组无 CSF 培养基对照（Ctrl media）
Phase 2：慢性暴露方案
- Day 19（T0）：基线电生理记录 + 首次 CSF 暴露
- Day 20（T+24h）：第二次记录 + 第二次 CSF 暴露
- Day 21（T+48h）：第三次记录 + 第三次 CSF 暴露
- Day 22（T+72h）：末次记录 + 免疫荧光
分析指标
- MFR：平均放电率（spikes/s）
- WMFR：加权平均放电率（仅活跃电极的微突触区域）
- Synchrony index：网络同步性指数（电极间相关性）
- 统计方法：双因素 ANOVA + Fisher LSD post-hoc, n=3 独立实验, 显著性阈值 *p<0.05
📊 核心结果与配图
1. DuaLink MEA 平台结构与功能验证
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 设计 NeoBentoPRO 高通量平台（16 器件集成），键合 Axion MEA，按位置颜色编码 40+ 电极（Ch1/1µ2/Ch2/2µ3/Ch3） |
| 发现什么 | 神经元在 Ch1/Ch3 接种后，D21 形成跨微通道突触连接；网络放电在 Ch1 与 Ch3 高度同步（Synchrony index > 0.5） |
| 说明什么 | 平台提供完整的"分区神经回路"模型——两侧胞体通过微通道互连，可分别施加药物刺激并读取全网络响应 |
Fig 1: DuaLink MEA 微流控平台架构。(a) NeoBentoPRO 整片实物图（手持 8 单元红色棉条显示连通流路，黑色虚线框标注单器件）；(b) QuarterBento 单器件放大（红色染料显示双侧培养室和成束微通道）；(c) 键合 Axion MEA 后的器件（流道与下方记录电极对齐布局，黑点代表微电极）；(d) 电极分区简化示意图（蓝绿绘制对称微流控结构，5 颜色编码图例对应 Ch1/1µ2/Ch2/2µ3/Ch3 五区）。本平台含 16 器件集成、5 区电极分布、PDMS 透明兼容荧光成像三大核心特征，是后续所有 AD 鉴别实验的物理基础。
2. 共培养神经元成熟度与功能验证
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在 Ch1/Ch3 共培养谷氨酸能与 GABA 能 hiPSC 神经元，D21 评估 Live/Dead、Sox2/Nestin、MAP2/vGlut/Tuj1/GABA marker |
| 发现什么 | Live/Dead：活细胞 > 95% / Sox2+Nestin < 5%（分化完成）/ GABA 区 GABA⁺ 细胞 ~80% / Gluta 区 vGlut1⁺ ~85%（分区特异性）/ D7-D21 spike bursts 渐进增强 |
| 说明什么 | hiPSC 衍生神经元在微流控芯片上达到成熟且保持分化偏向性，GABA 与谷氨酸能神经元分区培养为网络同步研究提供基础模型 |
*Fig 2: 谷氨酸能+GABA 能共培养表征。(a) 实验时间线（D0 接种 / D5 补液 / D7 首次记录 / D19 第二次 / D21 第三次+免疫荧光）；(b) D16 明场对比（两侧培养室可见神经元胞体）；(c) Live/Dead 荧光（绿色活细胞/红色死细胞）；(d) Sox2+Nestin 增殖 marker；(e) MAP2+vGlut+Tuj1 成熟神经元 marker；(f) Live/Dead 定量；(g) Sox2+Nestin 表达量 < 5%；(h) 特异性 marker 定量（GABA 区 GABA⁺ ~80%, Gluta 区 vGlut1⁺ ~85%）；(i) D7/D14/D21 raster plot；(j) MFR/WMFR/Synchrony 三指标柱状图（含 TTX 验证 * / ** / *** / ***）。10 个 panel 共同证明 hiPSC 衍生神经元在微流控平台上达到成熟且分区分化稳定。
3. TTX 验证网络响应特异性
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在 Ch1 或 Ch3 单侧施加 1 µM TTX，监测另一侧及微通道的 MFR/WMFR/Synchrony 变化 |
| 发现什么 | TTX 处理侧 Ch1 局部 MFR/WMFR 显著降低（p<0.001，）；微通道（1µ2+2µ3）WMFR 也下降（）但恢复更明显*；Synchrony 在 Ch1 单侧处理后显著降低 |
| 说明什么 | TTX 验证确认平台能特异读取"局部扰动→网络响应"的功能信号；微通道恢复力强说明突触可塑性完整；Synchrony 指数对单侧扰动最敏感 |
*Fig 3: TTX 处理验证网络响应。(a) TTX 暴露时间线（D16 记录 / D18 TTX Ch3 / D19 记录 / D19 TTX Ch1 / D20 记录）；(b) Ch1/Ch3 明场对照；(c) TTX Ch1 vs Ch3 前后 raster plot（电极编号 5-11，颜色由蓝→红渐变）；(d) MFR 柱状图（Ch1 红 vs Ch3 蓝，TTX 显著降低 *）；(e) WMFR（黄色 Ch1 vs 红色 Ch3，显著性 ** / **）；(f) WMFR Ch1 视角；(g) WMFR Ch3 视角；(h) Synchrony index（蓝色 Ch1 vs 红色 Ch3）；(i) Synchrony index Ch3 视角。9 个 panel（含 j/k 另页时给出）共同证明平台能特异性区分局部与全网络响应，是 AD CSF 实验的方法学基础。
4. Aβ 寡聚体暴露的电生理效应
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在微通道 1µ2 和 2µ3 两侧施加合成 Aβ 寡聚体（D19 起，T0/T24h/T48h/T72h 时序），监测 WMFR 绝对值与相对基线变化 |
| 发现什么 | 1µ2 和 2µ3 两侧 WMFR 在 T+24h 即开始下降（），T+48h 显著（），T+72h 极显著（***）；T0 vs T+48h/F±72h 均有显著 MFR / NMFR / Synchrony 下降；vehicle 归一化显示 Aβ 处理组 WMFR 低于 vehicle（timmer dependent） |
| 说明什么 | Aβ 寡聚体在 hiPSC 共培养神经网络上诱导时间依赖性电生理抑制效应——这是 AD 病理机制的功能读数；1µ2 与 2µ3 两侧响应相似说明 Aβ 通过突触传递而非局部毒性起作用 |
Fig 4: Aβ 暴露时间依赖性电生理效应。(a) 实验设计时间线（D19 T0 加药 / D20 T+24h 记录+补药 / D21 T+48h / D22 T+72h）；(b) 微通道 WMFR 绝对值柱状图（黄/红分别 1µ2 / 2µ3 组，误差棒 + 散点）；(c) WMFR 时间序列（* / ** / **）；(d) Synchrony index 柱状图（T+48h ，T+72h ns）；(e-g) MFR/WMFR/Synchrony 自身基线归一化箱线图（y=0 参考线）；(h-j) MFR/WMFR/Synchrony 溶媒对照归一化（差异指数 vs 时间）。10 panel 量化 Aβ 时间依赖性抑制效应，Synchrony 在 T+72h 标 ns 提示高浓度+长时间后网络崩溃进入稳态。
5. AD 患者 CSF vs NN 对照 CSF 鉴别
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 暴露 3 例 AD 患者 CSF（A1/A2/A3）+ 2 例 NN 对照 CSF（H1/H1/NN）+ 1 组空白培养基对照（Ctrl media），监测微通道 WMFR 绝对值与时间归一化变化 |
| 发现什么 | AD CSF 在 T+24h 即引起 WMFR 升高（A1 +100%, A2 +200%, A3 +150%）；NN CSF WMFR 平稳波动（< 50%）；Ctrl media 升高最显著（T+48h ~180% 极显著 ****）；归一化 AD - Ctrl 显示 T+48h/T+72h 显著负差（** / *** / ****） |
| 说明什么 | AD CSF 显著抑制了神经类器官随时间的自然放电成熟上升——这是与正常成熟轨迹的逆向偏移，可作为 AD 功能诊断的判别指标；NN CSF 与 Ctrl 类似（自然上升），与 AD CSF 形成"双向分离" |
Fig 5: AD 患者 CSF vs NN 对照 CSF 电生理鉴别。(a) 实验时间线（D19 起，T0/T24h/T48h/T72h，3 例 AD 患者 A1/A2/A3 + 2 例 NN 对照 H1/H2 + Ctrl media）；(b-d) AD 患者 CSF（A1/A2/A3）WMFR 柱状图——T+24h 升高 -**，范围 0-60 spikes/min；(e-f) NN 对照 CSF（H1/H2）WMFR 平稳，1 处 * 标记；(g) Ctrl media WMFR 持续升高（T+48h 达 ~42，**）；(h-m) WMFR 自身基线归一化——AD 组 T+24h 升高 100-250%，NN 组 < 50%，Ctrl ~180% 极显著；(n-o) WMFR 同期对照归一化箱线图——AD 组 T+48h/T+72h 显著负差（** / *** / ***），NN 组 ns。15 panel 量化 AD vs NN vs Ctrl 三类 CSF 的电生理特征差异，提供功能诊断判别基础。
6. 多指标判别分析与相关性矩阵
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对 60+ 电生理指标做 Pearson 相关性矩阵；阈值 0.7 二值化；按处理时长（24h/48h/72h）1µ2 处理散点图（WMFR % of baseline vs Synchrony Index % of baseline） |
| 发现什么 | WMFR 和 Synchrony 在 AD CSF 处理后反向变化（WMFR 上升而 Synchrony 下降或保持）；patient CSF 组椭圆在 WMFR-Synchrony 平面上明显向右上偏移；Ctrl media 始终接近 (0,0) 略偏右下 |
| 说明什么 | WMFR-Synchrony 双指标散点图可作为 AD CSF 鉴别可视化的实用判别图——3 名 AD 患者 CSF 在 48h/72h 时椭圆偏移方向一致，与 Ctrl media 完全分离，是临床转化可行的简化判别策略 |
Fig 6: 多指标判别分析与散点图。(a) 60+ 电生理指标的 Pearson 相关性矩阵（对称热图，色条 1.0-2.0）；(b) 阈值 0.7 二值化（橙色显著块 vs 深蓝背景）；(c) WMFR % of baseline vs Synchrony Index % of baseline 三时间点散点图（24h/48h/72h in 1µ2），颜色分组：A1/A2/A3 (蓝/红/绿) + H1/H2 (紫/浅橙) + Abeta (浅米色) + Ctrl (棕褐色)，同组样本绘制分布椭圆。3 panel 显示 WMFR-Synchrony 双指标在 AD CSF 与 Ctrl media 上的可视化判别可行性证据——AD CSF 椭圆向 WMFR 升高方向移动，Ctrl 始终接近 (0,0)。
💡 与代理产品的关联
论文中直接使用 / 引用的设备/平台：
- Netri NeoBentoPRO + DuaLink MEA — 法国 Netri 公司微流控器件（论文第一作者/通讯作者均在 Netri，平台由 Netri 内部开发）
- Axion Biosystems MEA — 高通量微电极阵列（Axion 是 Neurotech 领域 MEA 主流厂商）
与论文方法 / 结论相关的代理产品：
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| 3Brain BioCAM X HD-MEA | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 论文核心读数平台 MEA 的高密度升级版（4096 电极 vs Axion 64 电极），可用于高通量神经药筛场景；代理产品 |
| Celvivo ClinoStar / ClinoReactor | ⭐⭐ | 论文 CSF/CCM 暴露后的成熟培养可迁移到 ClinoReactor 长期维持场景；但论文使用的是 2D 微流控 + MEA，不是 3D 旋转 |
| Femtobiomed CellShot | ⭐ | 基因递送系统在 hiPSC 衍生阶段可加速分化；论文未涉及电转染但方向互补 |
面向客户（按 audience）：
- 对 CDMO/CMO 客户：本平台是 hiPSC 共培养 + 慢性 CSF 暴露 + MEA 读数的端到端解决方案，适合药代/毒理高通量筛选服务
- 对 神经药企客户（AD/PD/HD/ALS 药企）：本平台可作为候选化合物早期筛选工具，特别是验证候选药对网络响应的特异性
- 对 临床研究机构：3 患者小样本证明 WMFR 是有潜力的诊断标志，需要更大队列验证（n=10-30 AD + n=10-30 NN + 其他神经退行性疾病如 PD/HD/FTD）
🏷️ 结论
- 平台可行性证明：NeoBentoPRO + DuaLink MEA + hiPSC 共培养平台能稳定记录分区神经网络的电生理响应，TTX 验证确认了局部-全网络响应特异性
- Aβ 病理读数：合成 Aβ 寡聚体在微通道区诱导时间依赖性 WMFR 抑制，1µ2 与 2µ3 两侧响应一致，提示Aβ 通过突触传递而非局部毒性起作用
- CSF 鉴别验证：3 例 AD 患者 CSF 在 WMFR 上呈现与正常成熟相反的偏移（Ctrl 上升，AD 抑制），与 2 例 NN 对照显著分离——证明 CSF 携带可读取的 AD 功能信号
- 判别指标选择：WMFR 是最敏感指标（Ctrl T+48h +180% 极显著 **** vs AD T+48h 显著 -50 to -100 vs 同期对照）；Synchrony 次敏感；MFR 在某些组别响应较弱
- 临床转化路径：从本研究到临床诊断仍需 4 步——更大样本量（30+ AD/NN）、跨中心验证、其他神经退行性疾病（PD/HD/FTD）CSF 鉴别、CSF 生物标志物整合
📖 文献信息
| 项目 | 内容 |
|---|---|
| 标题 | Functional discrimination of CSF from Alzheimer's patients in a brain on chip platform |
| 期刊 | Scientific Reports |
| 年份 | 2025 |
| 作者 | Miny L, Rontard J, Allouche A, Violle N, Dubuisson L, Batut A, Ponomarenko A, Talbi R, Gautier H, Maisonneuve BGC, Roux S, Larramendy F, Honegger T, Quadrio I |
| DOI | 10.1038/s41598-025-97186-x |
| PMID | 40804138 |
| 全文 PDF | Netri_AD_brain_on_chip_40804138.pdf（Cloudreve 永久 sign URL，10 年有效期至 2036-10-02） |
| 配图 | 6 张原始图（Fig 1-6）已上传 Wiki.js 公网图床 |
📥 原文 PDF 下载
| 文件 | 下载链接 |
|---|---|
| 原文 PDF | Netri_AD_brain_on_chip_40804138.pdf |
转发语: Scientific Reports 重磅！Netri 团队 2025 报告基于 DuaLink MEA 微流控 + hiPSC 衍生神经元 + 3 例 AD 患者 CSF 慢性暴露，证明 WMFR-Stress 双指标可作为 AD 功能鉴别标志物。3 名 AD 患者 CSF 在 T+48h 时 WMFR 显著低于同期空白对照（** / *** / ****），与 NN 对照和 Ctrl media 三向分离——为神经退行性疾病早期分层入组提供了可重复的电生理筛选工具。🧠⚡
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