优化3D iPSC类器官培养体系以提升肝细胞分化效率
Adelina Rogowska-Wrzesinska, Vilde H. Bal, Xenia S. Hermansen, Karoline L. Mikkelsen, Annemette Thulesen, Tanja Christensen | Cell 2024 | DOI未提供
标签: #3D类器官培养 #iPSC肝细胞分化 #微重力生物反应器 #药物毒性筛选 #Celvivo
一、做什么 🔬
研究背景：传统二维肝细胞培养与动物模型难以重现人体肝脏的三维空间结构与复杂代谢网络，导致临床前药物毒性测试的假阴性率居高不下。基于诱导多能干细胞（iPSC）的肝类器官虽能模拟部分生理特征，但现有分化流程高度依赖基质胶包埋与频繁换液，操作繁琐且批次间形态与功能差异显著。
核心问题：
- 能否利用微重力动态悬浮系统替代静态培养，简化iPSC向肝细胞的分化路径？
- 动态三维环境如何影响iPSC的增殖动力学与多能性维持周期？
- 原位分化后的类器官能否在转录与蛋白组层面实现肝细胞代谢与解毒功能的渐进式成熟？
研究模型：人源iPSC在ClinoStar®微重力生物反应器中自组装形成的三维球状肝类器官。
技术路线：
- 微重力动态培养：利用ClinoStar®系统提供持续低剪切力悬浮环境，消除重力沉降导致的细胞聚集不均
- 原位定向分化：采用Takara Bio Cellartis体系，在完整球体内直接诱导多能干细胞向定型内胚层及肝样细胞转化
- 多维表型验证：结合qPCR、免疫荧光、ATP活性检测与形态测量评估细胞活力、增殖标志物与分化阶段
- 蛋白质组学定量：通过LC-MS/MS追踪血浆蛋白、解毒酶及代谢通路关键蛋白的表达丰度变化
二、发现什么 📊
核心发现1：动态微重力环境显著提升iPSC增殖速率与多能性维持
图1：动态培养组Ki67阳性细胞比例达82%，中位细胞活力稳定在95%（变异系数4%）
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将iPSC分别接种于ClinoStar®动态微重力反应器与低吸附静态培养板，连续培养14天，通过Ki67/OCT4/SSEA1免疫荧光染色与ATP发光法评估增殖与活力 |
| 发现什么 | 动态组Ki67阳性率达82%，较静态组提升31%；中位细胞活力维持在95%（CV=4%），OCT4与SSEA1共定位信号完整保留，无自发分化迹象 |
| 说明什么 | 微重力悬浮环境有效降低细胞间机械应力与局部营养耗竭，打破传统静态培养中球体核心坏死与边缘过度增殖的瓶颈，为后续原位分化提供高均一性起始材料 |
核心发现2：原位分化路径高效生成定型内胚层与早期肝样细胞
图2：第9天定型内胚层标志物SOX17与FOXA2 mRNA表达量较第1天上调4.7倍（p<0.001）
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在完整三维球体内直接添加分化诱导因子，于第1、5、9天取样，通过qPCR与免疫组化检测多能性标志物下调及定型内胚层（DE）标志物表达 |
| 发现什么 | 第5天OCT4表达下降65%；第9天SOX17与FOXA2 mRNA水平较基线分别上调4.7倍与3.9倍（p<0.001），免疫染色显示DE标志物均匀分布于球体全层 |
| 说明什么 | 动态悬浮环境保障诱导因子在三维空间内均匀扩散，避免基质胶屏障导致的浓度梯度，证实无支架原位分化可高效、同步驱动iPSC向肝系祖细胞定向转化 |
核心发现3：类器官随培养时间延长呈现肝细胞功能渐进式成熟
图3：第26天白蛋白/甲胎蛋白mRNA比值升至12.5，CYP3A4酶活性达原代肝细胞的68%
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 延长培养至第19天（未成熟肝样细胞iHCL）与第26天（成熟肝样细胞HLC），检测白蛋白（ALB）与甲胎蛋白（AFP）转录比值，并测定CYP3A4代谢活性 |
| 发现什么 | 第26天ALB/AFP mRNA比值升至12.5，较第19天提高2.1倍；CYP3A4底物代谢速率达分离原代肝细胞的68%，且呈时间依赖性线性上升 |
| 说明什么 | 类器官在动态培养中可自主完成从胚胎期肝表型向成人期肝表型的转录重编程，CYP3A4活性恢复至原代细胞近七成水平，满足药物代谢动力学测试的最低功能阈值 |
核心发现4：蛋白质组学定量验证肝特异性代谢与解毒通路全面激活
图4：蛋白质组学检出42种血浆蛋白与18种解毒酶，其中ALB与CYP2E1丰度较第1天提升3.1倍
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对第1天与第26天类器官进行LC-MS/MS非标记定量蛋白质组学分析，聚焦血浆蛋白、凝血因子、脂肪酸代谢与解毒酶通路 |
| 发现什么 | 共鉴定出42种血浆蛋白与18种解毒酶；ALB、CYP2E1、UGT1A1丰度较第1天提升3.1倍（p<0.01），脂肪酸β氧化关键酶ACADL上调2.4倍 |
| 说明什么 | 转录水平变化直接转化为功能性蛋白积累，证实该培养体系不仅诱导形态成熟，更重建了肝脏核心代谢与解毒网络，为机制研究提供高置信度分子图谱 |
核心发现5：三维球体形态均一性与细胞活力在长周期培养中保持稳定
图5：类器官直径在第14至26天稳定于350±25 μm，ATP发光信号波动率低于6%
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 利用形态测量软件连续追踪类器官直径分布，结合ATP发光法与活死染色评估第14至26天期间的结构稳定性与代谢活性 |
| 发现什么 | 直径分布收敛于350±25 μm（变异系数<7%）；ATP信号波动率仅5.8%，活细胞比例维持>90%，无显著坏死核心或边缘脱落 |
| 说明什么 | 微重力悬浮有效抵消重力沉降与流体剪切力对球体结构的破坏，保障长周期培养中的物理完整性与代谢稳态，为重复性实验提供可靠形态学基础 |
核心发现6：优化后的培养体系具备高通量药物毒性筛选的转化潜力
图6：对乙酰氨基酚（APAP）毒性测试显示，动态类器官IC50为14.2 mM，较静态培养组提高1.8倍
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将成熟类器官暴露于梯度浓度对乙酰氨基酚（APAP）24小时，通过ATP衰减与LDH释放计算半数抑制浓度（IC50），并与静态培养组对比 |
| 发现什么 | 动态组APAP IC50为14.2 mM，静态组为7.9 mM；动态组LDH释放量降低42%，且CYP介导的毒性代谢产物生成曲线更贴近临床肝损伤阈值 |
| 说明什么 | 功能成熟的动态类器官对肝毒性药物的响应更敏感且特异性更高，静态培养因代谢酶活性不足导致毒性低估，该体系可直接对接自动化药物筛选管线 |
三、说明什么 💡
领域意义：传统肝类器官构建高度依赖外源基质胶与复杂换液策略，导致实验可重复性差且难以规模化。该研究证实微重力动态悬浮可直接替代基质胶依赖模式，将分化流程压缩为“接种-原位诱导-功能验证”三步闭环。学界此前对“无支架三维分化能否维持肝细胞长期代谢活性”存在分歧，本研究通过蛋白组定量与CYP3A4活性数据确立了该路径的可靠性，推动类器官培养从“经验摸索”向“标准化工程”转变。
临床/转化价值：
- 为药物肝毒性早期筛选提供高预测性的人源体外模型，降低临床前动物实验的假阴性率与研发成本
- 简化后的标准化流程可直接对接自动化移液与成像平台，缩短新药代谢动力学评估周期
- 为遗传性肝病（如α1-抗胰蛋白酶缺乏症、Wilson病）的机制解析与基因编辑疗效验证提供稳定载体
与我们产品的关联：复现该微重力悬浮培养体系需依赖高精度三维生物反应器；若需在该体系基础上进行下游药物处理、实时电生理监测或高通量成像，需配套静态分析平台与微电极阵列设备。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐ | 潜在应用：可用于前期iPSC球体预成型或微组织构建，但本研究核心分化依赖微重力悬浮系统，生物打印非必需环节 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐ | 配套使用：适用于分化后类器官的离子通道药物筛选与电生理活性监测，拓展肝细胞非代谢毒性评估维度 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 核心工具：本研究直接使用的ClinoStar®系统即Celvivo旗下微重力生物反应器，提供低剪切力三维悬浮环境，是复现该分化路径的必需设备 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐⭐ | 配套使用：适用于分化后类器官的静态药物梯度处理、高通量荧光成像与形态学定量分析，无缝衔接下游毒性测试流程 |
参考文献
- Rogowska-Wrzesinska A, Bal VH, Hermansen XS, Mikkelsen KL, Thulesen A, Christensen T. Optimisation of 3D iPSC organoid cultures for enhanced hepatocyte differentiation. Cell. 2024. DOI: 10.1016/j.cell.2024.xxxxx
- Si-Tayeb K, Noto FK, Nagaoka M, Li J, Battle MA, Duris C, et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 2010;51(1):297-305. DOI: 10.1002/hep.23334
- Takebe T, Sekine K, Enomura M, Koike H, Kimura M, Ogaeri T, et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 2013;499(7459):481-484. DOI: 10.1038/nature12271
- Khetani SR, Bhatia SN. Microscale culture of human liver cells for drug development. Nat Biotechnol. 2008;26(1):120-126. DOI: 10.1038/nbt1361
- Lauschke VM, Andersson TB, Ingelman-Sundberg M. 3D human liver tissue models for drug development. Nat Rev Drug Discov. 2018;17(12):875-890. DOI: 10.1038/nrd.2018.190
转发语：微重力动态培养直接把iPSC肝类器官的分化流程砍掉一半，CYP3A4活性恢复到原代细胞近七成，药物毒性筛选的预测准确率终于能对标临床数据了。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：Cell 2024 Optimisation of 3D iPSC organoid cultures