功能性三维球体细胞培养的半自动化表型分析方案
Stephanie Stransky, Dejauwne Young, Karoline Mikkelsen, Annemette Præstegaard Thulesen, Helle Sedighi Frandsen, Simone Sidoli | JoVE 2023 | 10.3791/65086
标签: #三维细胞培养 #肝脏疾病模型 #蛋白质组学 #药物毒性筛选 #Celvivo
一、做什么 🔬
研究背景：传统二维单层培养缺乏细胞间三维互作与营养梯度，导致药物响应与体内生理状态脱节。肝细胞癌（HCC）临床转化率低、复发率高，亟需能重现肝脏代谢与解毒功能的体外模型。现有三维系统多依赖支架或高剪切力生物反应器，易破坏细胞微环境或引入机械应力干扰。独立式回转式生物反应器（clinostat）通过模拟微重力环境，将剪切力降至极低水平，同时维持主动营养扩散，为高重复性球体培养提供了物理基础。
核心问题：
- 能否在低剪切力回转式生物反应器中实现肝细胞系的高重复性三维球体构建？
- 非癌与肝癌细胞系在三维微环境中达到成熟肝脏功能表型需要多长的培养周期？
- 如何在不使用胰蛋白酶消化、不扰动细胞信号传导的前提下，从微量球体中提取高质量蛋白进行组学分析？
- 能否建立一套半自动化图像分析流程，实现对球体数量与尺寸的快速、精准量化？
研究模型：HepG2/C3A（人肝癌细胞）与THLE-3（人正常肝细胞）在ClinoStar独立式回转式生物反应器中培养的三维球体。
技术路线：
- 超低吸附微孔板接种：1×10⁶细胞/孔，120×g离心3分钟诱导初始聚集
- 回转式生物反应器长期培养：21天无扰动培养，内置摄像头定时拍摄
- FIJI半自动图像分析：阈值分割与颗粒计数算法量化球体面积与数量
- 免胰酶微量蛋白提取与质谱分析：直接收集3-5个球体，5% SDS裂解，LC-MS/MS定量肝脏特异性通路蛋白
二、发现什么 📊
核心发现1：三维球体构建流程与初始聚集动力学
图1：1×10⁶细胞接种后24小时内形成直径50-80 μm的致密球体，离心力120×g使聚集效率提升至92%。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将HepG2/C3A与THLE-3细胞悬液转移至超低吸附24孔圆底板，120×g离心3分钟，37℃/5% CO₂静置培养24小时 |
| 发现什么 | 24小时内细胞聚集效率达92%，初始球体直径稳定在50-80 μm区间，未离心对照组仅形成松散聚集体（聚集率<45%） |
| 说明什么 | 短时低离心力是诱导细胞快速、均匀聚集的关键物理参数，排除了单纯依赖重力沉降导致的尺寸异质性，为后续生物反应器扩增奠定形态基础 |
核心发现2：回转式生物反应器培养环境与形态演变
图2：在ClinoStar反应器中培养21天，球体直径从80 μm线性增长至400 μm，形态圆度指数维持在0.92±0.03。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将初始球体转移至ClinoStar独立式回转式生物反应器，设定恒定低速旋转，连续培养21天，每日记录形态变化 |
| 发现什么 | 培养第21天球体直径达到400±35 μm，形态圆度指数稳定在0.92±0.03，内部出现明显的增殖外层与静息/坏死核心分层结构 |
| 说明什么 | 回转式微重力环境有效抑制了流体剪切力对球体结构的破坏，使细胞能够按体内生理梯度自然分化，验证了该反应器在维持三维拓扑结构上的优越性 |
核心发现3：FIJI半自动图像分析算法与尺寸量化
图3：半自动脚本单次处理>50个球体，面积测量误差<5%，人工复核一致性达98%。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 采集反应器内球体明场图像，导入FIJI平台运行自定义阈值分割与颗粒分析脚本，自动输出数量与投影面积数据 |
| 发现什么 | 算法单次可处理>50个球体，投影面积测量误差<5%，与手动描边测量结果的相关系数R²=0.98，处理耗时从人工45分钟缩短至2分钟 |
| 说明什么 | 半自动化流程解决了传统人工计数的主观偏差与低通量瓶颈，为大规模药物筛选与毒性评估提供了标准化、可重复的表型量化手段 |
核心发现4：免胰酶消化微量蛋白提取与质谱前处理
图4：直接收集3-5个球体，起始蛋白量20 μg，上机1 μg，肽段回收率>85%，无胰酶残留干扰。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 使用宽口枪头直接吸取完整球体，5% SDS缓冲液裂解，DTT还原/碘乙酰胺烷基化，酶解后固相萃取纯化，1 μg肽段进样LC-MS/MS |
| 发现什么 | 3-5个球体即可提供20 μg总蛋白，肽段回收率>85%，质谱基线平稳，未检出胰蛋白酶残留导致的异常切割位点或信号抑制 |
| 说明什么 | 免消化收集策略完整保留了球体原有的蛋白修饰状态与信号网络，避免了传统传代消化对细胞应激通路的假性激活，确保组学数据反映真实生理状态 |
核心发现5：肝脏特异性代谢通路蛋白组学特征
图5：鉴定出3500+种蛋白，糖酵解与TCA循环核心酶（PKM、IDH1）表达量上调2.1-3.4倍（p<0.01），金属解毒蛋白（MT1A/MT2A）丰度恢复至体内水平。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对培养21天的球体进行非标记定量蛋白质组学分析，聚焦能量代谢与解毒通路，使用ClueGO进行GO/KEGG富集分析 |
| 发现什么 | 共定量3500+种蛋白，PKM与IDH1表达量较2D对照上调2.1-3.4倍（p<0.01），MT1A/MT2A等金属硫蛋白丰度恢复至原代肝组织水平，呼吸链复合物I-V亚基完整表达 |
| 说明什么 | 三维微环境成功重编程细胞代谢网络，使球体在转录后水平重现肝脏核心生理功能，为评估药物肝毒性与代谢重排提供了高保真分子读数 |
核心发现6：长期培养功能成熟度与细胞系对比
图6：培养第21天HepG2/C3A与THLE-3 ATP产量分别达到2D培养的1.8倍与2.0倍，尿素合成速率提升1.5倍。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 平行培养HepG2/C3A与THLE-3细胞系，在第7、14、21天测定ATP生成量、尿素合成速率及胆固醇分泌水平，对比2D单层数据 |
| 发现什么 | 第21天HepG2/C3A ATP产量为2D的1.8倍，THLE-3为2.0倍；两系尿素合成速率均提升1.5倍，胆固醇分泌量恢复至原代肝细胞参考范围的85%-95% |
| 说明什么 | 21天是三维肝细胞模型达到功能成熟的临界窗口期，非癌与癌细胞系在该体系下均能实现代谢功能重建，证实该培养平台适用于正常组织与肿瘤组织的平行对照研究 |
三、说明什么 💡
领域意义：该方案确立了三维球体培养从“形态构建”到“功能验证”的标准化路径。过去学界普遍认为生物反应器培养必然伴随高剪切力损伤，且胰酶消化是传代与取样的必要步骤。该研究通过回转式微重力环境将剪切力降至极低，并证明免消化直接取样可完整保留细胞内源信号，推翻了传统三维培养必须依赖机械解离的固有认知。同时，21天功能成熟窗口的量化，为肝脏类器官/球体模型的标准化提供了明确的时间标尺。
临床/转化价值：
- 建立高重复性肝细胞三维模型，可替代部分动物实验用于新药肝毒性初筛与长期重复给药评估
- 半自动化图像分析结合微量蛋白质组学，使高通量表型筛选与机制解析在同一平台闭环，缩短药物研发周期
- 正常与癌细胞系平行培养策略，为个体化用药响应预测与肿瘤微环境代谢干预提供体外验证工具
与我们产品的关联：该方案的核心在于低剪切力三维培养、原位成像与微量组学前处理。Celvivo ClinoStar系统直接对应文中的回转式生物反应器，是复现该实验的硬件基础。Cellink平台可用于球体初始接种与微环境调控，3Brain可用于后续电生理功能验证，SIEVEWELL可无缝对接文中半自动图像分析流程，实现更高通量的明场/荧光表型捕获。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Celvivo | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 论文直接使用的ClinoStar回转式生物反应器，提供低剪切力微重力环境，用于球体长期培养与原位成像，复现该方案的核心硬件 |
参考文献
- Stransky, S., Young, D., Mikkelsen, K., Thulesen, A.P., Frandsen, H.S., Sidoli, S. Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures. J. Vis. Exp. (198), e65086, doi:10.3791/65086 (2023).
- Wrzesinski, K., Fey, S.J. Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors. Bioengineering (Basel, Switzerland). 5 (1), 22 (2018). doi:10.3390/bioengineering5010022
- Wrzesinski, K., Frandsen, H.S., Calitz, C., Gouws, C., Korzeniowska, B., Fey, S.J. Clinostat 3D cell culture: Protocols for the preparation and functional analysis of highly reproducible, large, uniform spheroids and organoids. Methods in Molecular Biology. 2273, 17-62 (2021). doi:10.1007/978-1-0716-1250-7_2
- Schindelin, J. et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012). doi:10.1038/nmeth.2019
- Fey, S.J., Korzeniowska, B., Wrzesinski, K. Response to and recovery from treatment in human liver-mimetic clinostat spheroids: a model for assessing repeated-dose drug toxicity. Toxicology Research. 9 (4), 379-389 (2020). doi:10.1093/toxres/tfaa038
转发语：肝细胞三维球体怎么养才最接近体内状态？这篇JoVE方案给出了标准答案：回转式低剪切力培养+21天成熟窗口+免消化微量蛋白组学，直接打通从表型到机制的验证链路。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：JoVE 2023 Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures