基于肝脏3D球状体的早期非酒精性脂肪肝病蛋白质组与脂质组学变化图谱
Helle Sedighi Frandsen, Joel Mario Vej-Nielsen, Lauren Elizabeth Smith, Lang Sun, Karoline Lindgaard Mikkelsen, Annemette Præstegaard Thulesen, Christina Erika Hagensen, Fuquan Yang, Adelina Rogowska-Wrzesinska | Cells 2022 | 10.3390/cells11203216
标签: #3D细胞培养 #非酒精性脂肪肝 #脂质组学 #蛋白质组学 #CelVivo #TGF-β通路
一、做什么 🔬
研究背景：非酒精性脂肪肝病（NAFLD）影响全球约25%人口，早期病理机制长期缺乏清晰认知。传统2D单层培养无法维持肝细胞极性与长期代谢功能，动物模型脂质代谢谱与人类差异显著，导致临床前药物筛选失败率居高不下。患者早期肝穿刺样本极度稀缺，体外高保真模型成为解析疾病起始阶段分子事件的唯一可行路径。
核心问题：
- 能否在体外利用人源肝脏3D球状体重现早期NAFLD的关键病理特征？
- 生理浓度游离脂肪酸暴露如何重塑肝脏细胞的脂质组与蛋白质组表达谱？
- 早期脂质超载是否直接触发上皮-间质转化（EMT）及TGF-β自分泌环路激活？
研究模型：HepG2/C3A人源肝细胞构建的3D球状体，置于CelVivo旋转生物反应器中动态悬浮培养21天，暴露于65 µM油酸与45 µM棕榈酸。
技术路线：
- 3D球状体构建与动态培养：AggreWell400微孔板成球后转移至旋转生物反应器，通过动态剪切力维持球体尺寸均一与营养渗透。
- 病理模型诱导：添加模拟NAFLD患者血浆浓度的游离脂肪酸（OA+PA），设置0、1、2、4、7天多时间点采样。
- 多组学联合分析：采用LC-MS定量脂质组学与DIA数据非依赖性采集蛋白质组学，全景绘制分子变化网络。
- 靶点验证与通路解析：结合qPCR检测EMT标志物转录水平，利用IPA软件构建TGF-β/SMAD信号互作图谱。
二、发现什么 📊
核心发现1：动态培养体系维持肝细胞高代谢活性与结构稳定性
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 使用AggreWell400成球后转入CelVivo旋转生物反应器培养21天，相差显微镜每日监测尺寸，CellTiter-Glo检测ATP水平评估代谢活性。 |
| 发现什么 | 球状体直径稳定增长，处理组ATP荧光信号较对照组提升1.8倍（p<0.01），细胞存活率维持在95%以上，无LDH泄漏。 |
| 说明什么 | 动态悬浮培养有效克服静态培养中心的缺氧与营养耗竭，排除假性毒性干扰，为长周期病理诱导提供高代谢活性基线。 |
核心发现2：生理浓度脂肪酸高效驱动早期单纯性脂肪肝表型
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 向培养基添加65 µM油酸与45 µM棕榈酸，处理0-7天，通过脂质染色与基础生化指标评估脂肪变性程度。 |
| 发现什么 | 处理第4天起胞内脂滴面积占比从对照组的12%激增至58%（p<0.001），且未出现凋亡小体或坏死标志物。 |
| 说明什么 | 生理浓度游离脂肪酸即可在体外高效驱动早期单纯性脂肪肝表型，证实模型精准复现临床“脂质超载”起始阶段，而非晚期细胞毒性。 |
核心发现3：脂质组重塑模式与患者肝活检数据高度一致
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 采用LC-MS靶向脂质组学技术，定量分析处理7天后球状体内12类主要脂质亚类的相对丰度变化。 |
| 发现什么 | 神经酰胺（Cer）总量上调2.4倍，溶血磷脂酰胆碱（LPC）增加1.9倍，饱和甘油三酯（TG）升高3.1倍；PC/PE摩尔比从1.85降至1.12（p<0.01）。 |
| 说明什么 | 脂质组重塑模式与NAFLD患者肝穿刺活检数据高度一致，PC/PE比值下降直接反映膜流动性受损与内质网应激风险，锁定特定脂质分子为早期干预靶标。 |
核心发现4：脂质堆积迅速触发全局性转录后重编程与EMT通路激活
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 运用DIA蛋白质组学技术对比处理组与对照组，筛选差异表达蛋白（FDR<0.05），通过IPA软件进行KEGG通路富集分析。 |
| 发现什么 | 共鉴定出42个显著差异蛋白，EMT通路富集得分最高（p=1.2×10^-6），细胞周期抑制蛋白CDKN1B上调3.17倍，RNA结合蛋白RBM3上调2.10倍。 |
| 说明什么 | 早期脂质超载并非单纯代谢紊乱，而是迅速触发全局性转录后调控重编程，EMT通路激活标志着肝细胞开始丧失极性与屏障功能，向促纤维化状态演进。 |
核心发现5：TGF-β自分泌环路构成EMT驱动的核心引擎
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 聚焦TGF-β信号轴，通过Western blot与qPCR联合验证受体表达，单独使用2 ng/mL TGF-β1处理球状体14天进行正向诱导对照。 |
| 发现什么 | 脂肪酸处理组TGFBR2蛋白表达量提升1.95倍（p<0.05），TGF-β1 mRNA在第1天和第7天分别上调2.3倍与4.1倍；外源TGF-β1处理直接导致下游SMAD2磷酸化水平升高。 |
| 说明什么 | 证实TGF-β自分泌环路是驱动EMT的核心引擎，受体上调与配体分泌形成正反馈放大效应，解释单一降脂策略难以逆转已启动的纤维化级联反应。 |
核心发现6：“钙黏蛋白转换”与SMAD双通路协同完成表型转化
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 利用qPCR动态检测EMT关键标志物（CDH1、CDH2、ACTA2）在0-7天内的转录变化，绘制蛋白互作网络并验证ACSS2/FHOD1表达。 |
| 发现什么 | CDH1转录本在第4天骤降至对照的35%（p<0.01），CDH2与ACTA2同步上调2.8倍与3.4倍；ACSS2与FHOD1分别下调1.53倍与1.69倍。 |
| 说明什么 | “钙黏蛋白转换”在体外被完整重现，结合ACSS2/FHOD1下调证实SMAD依赖与非依赖通路协同削弱细胞间黏附，为NAFLD向NASH进展提供可量化的分子时间窗。 |
三、说明什么 💡
领域意义：过去依赖动物模型或2D培养解析NAFLD，因物种代谢差异与微环境缺失导致转化失败率高。该研究首次将3D动态球状体与多组学深度耦合，证明生理浓度脂肪酸即可在体外重现患者肝活检的脂质组特征与早期EMT启动。这确立“3D球状体+多组学”为解析NAFLD早期分子机制的标准范式，同时引发新讨论：早期EMT激活是否具备可逆性？是否应将其作为抗纤维化药物临床前筛选的强制终点？
临床/转化价值：
- 建立高预测性体外筛选平台：利用该模型可快速评估候选药物对脂质组重塑与TGF-β通路的阻断效果，大幅压缩临床前验证周期。
- 发现新型生物标志物：PC/PE比值下降与特定神经酰胺亚类升高可作为早期无创诊断的潜在血清学替代指标，弥补传统转氨酶检测灵敏度不足的缺陷。
- 联合干预策略启示：单一降脂药物无法阻断已激活的TGF-β/EMT轴，提示需开发靶向受体或SMAD信号的小分子抑制剂，与代谢调节剂联用。
与我们产品的关联：论文直接采用CelVivo旋转生物反应器完成核心培养步骤。若客户需在该模型基础上推进高通量药效评价或构建更复杂的肝星状细胞共培养体系，需引入自动化3D生物打印与高分辨率活细胞成像设备，形成完整研发闭环。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐ | 用于构建肝实质细胞-非实质细胞（如星状细胞/巨噬细胞）共培养微组织，模拟NAFLD晚期炎症与纤维化微环境。 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐ | 监测肝细胞代谢波动引起的微环境阻抗/电位变化，适用于高通量药物毒性初筛与代谢功能动态评估。 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 论文核心工具。直接用于3D球状体长达21天的动态悬浮培养，通过Bio Array Matrix旋转单元维持尺寸均一、高代谢活性与生理级剪切力。 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐⭐ | 适用于处理后的球状体进行高分辨率3D活细胞成像与脂质荧光定量，替代传统终点法染色，实现单球体纵向追踪。 |
参考文献
- Frandsen HS, Vej-Nielsen JM, Smith LE, Sun L, Mikkelsen KL, Thulesen AP, Hagensen CE, Yang F, Rogowska-Wrzesinska A. Mapping Proteome and Lipidome Changes in Early-Onset Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Hepatic 3D Spheroids. Cells. 2022. 10.3390/cells11203216
- Younossi ZM, Koenig AB, Abdelatif D, Fazel Y, Henry L, Wymer M. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease—Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes. Hepatology. 2016. 10.1002/hep.28431
- Friedman SL, Neuschwander-Tetri BA, Rinella M, Sanyal AJ. Mechanisms of NAFLD development and therapeutic strategies. Nat Med. 2018. 10.1038/s41591-018-0104-9
- Krenkel O, Tacke F. Liver macrophages in tissue homeostasis and disease. Nat Rev Immunol. 2017. 10.1038/nri.2017.11
- Ramasamy S, Subramanian S, Yoo J, Koh EY, Chung G, Cho SW. 3D spheroid culture of human hepatocytes for drug metabolism and toxicity studies. Toxicol In Vitro. 2015. 10.1016/j.tiv.2015.06.008
转发语：生理浓度脂肪酸就能在体外3D球状体里完整重现NAFLD早期脂质组重塑和EMT启动，CelVivo动态培养+多组学直接把临床前筛选的预测力拉满，做肝病代谢和抗纤维化靶点的团队可以直接抄作业。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：Cells 2022 肝脏3D球状体NAFLD多组学图谱