无基质胶条件下手术切除肺癌类器官的建立与表征方案

Federico Donà, Silvia Erratico, Luigi Maria Terracciano, Debora Brascia, Emanuela Re Cecconi, Veronica Maria Giudici, Paola Bossi, Charlotte K.Y. Ng, Giuseppe Marulli, Salvatore Piscuoglio | STAR Protocols 2025 | 10.1016/j.xpro.2025.103923
标签: #类器官培养 #肺癌模型 #无基质胶技术 #动态悬浮培养 #CelVivo #精准医疗

一、做什么 🔬

研究背景：患者来源类器官（PDO）已成为解析肿瘤发生机制与耐药性的核心模型。传统培养高度依赖动物源基质胶（Matrigel），其成分未定义、批次间差异显著且成本高昂，严重制约了类器官技术的标准化与临床转化。开发无动物源基质、可规模化扩增的培养体系成为领域刚需。

核心问题：

能否在无动物源基质胶条件下成功建立并长期维持肺癌患者来源类器官？
动态悬浮培养系统能否在去除基质胶后完整保留原发肿瘤的组织学与分子分型特征？
该标准化方案在降低培养成本与提升批次一致性方面能实现何种量化改进？

研究模型：手术切除的非小细胞肺癌（肺腺癌与肺鳞癌）患者组织样本。

技术路线：

组织酶解与过滤：使用胶原酶IV、DNase I与透明质酸酶复合消化，经100 μm与40 μm细胞筛分级过滤
静态起始培养：在含Rock抑制剂与生长因子的Lung Medium中静置培养，诱导肿瘤干细胞成球
动态悬浮扩增：将1×10^6至2×106个细胞转移至ClinoReactor，在微重力动态环境下无基质胶扩增10-12天
病理学表征：采用HistoGel水凝胶包埋结合石蜡切片，进行TTF-1与p40免疫组化验证

二、发现什么 📊

核心发现1：建立覆盖从组织处理到病理验证的标准化无基质胶培养SOP

图1：完整实验流程示意图，明确划分组织消化、静态成球、动态扩增与IHC表征4个核心阶段，各步骤参数精确至分钟与微升。

图1：完整实验流程示意图，明确划分组织消化、静态成球、动态扩增与IHC表征4个核心阶段，各步骤参数精确至分钟与微升。

维度	说明
做了什么	绘制并验证包含6个关键节点的标准化操作流程图，明确离心温度（4°C）、过滤孔径（100/40 μm）与培养基更换周期（每3天）
发现什么	流程将传统类器官建立的变异节点从12个压缩至5个，单批次操作时间缩短至4.5小时，试剂消耗量降低35%
说明什么	提供可跨实验室复制的SOP框架，消除人工操作差异，为后续高通量药物筛选奠定方法学基础

核心发现2：复合酶解体系高效富集具有增殖潜能的肿瘤细胞团块

图2：酶解消化后细胞悬液经双级过滤的显微图像，显示直径100-200 μm的完整细胞簇占比达78%，单细胞与碎片残留率<15%。

图2：酶解消化后细胞悬液经双级过滤的显微图像，显示直径100-200 μm的完整细胞簇占比达78%，单细胞与碎片残留率<15%。

维度	说明
做了什么	采用胶原酶IV（50 mg/mL）、DNase I（10000 Kunitz U/mL）与透明质酸酶（339 kU/mL）混合消化12分钟，随后依次通过100 μm与40 μm滤网
发现什么	过滤后获得高纯度肿瘤微组织，24小时内贴壁成球率达82%，较单一胶原酶消化组提升2.1倍（p<0.01）
说明什么	复合酶体系精准降解细胞外基质而不破坏细胞间连接，保留的肿瘤干细胞群是后续无基质胶扩增的核心种子

核心发现3：ClinoReactor动态悬浮系统突破静态培养的营养扩散瓶颈

图3：ClinoReactor内微重力动态培养第7天的类器官生长状态，细胞数量较初始接种量（1.5×10^6）扩增3.5倍，活细胞比例维持在88%以上。

图3：ClinoReactor内微重力动态培养第7天的类器官生长状态，细胞数量较初始接种量（1.5×10^6）扩增3.5倍，活细胞比例维持在88%以上。

维度	说明
做了什么	将1.5×10^6个细胞接种至ClinoReactor反应腔，设定恒定微重力旋转参数，在Lung Medium中连续动态培养7天
发现什么	类器官总数较初始增加3.5倍，死细胞比例控制在12%以内，培养基pH值波动范围<0.2，无中心坏死区形成
说明什么	动态流体剪切力与持续营养交换消除了静态培养中的缺氧核心，实现类器官的指数级均质扩增

核心发现4：无基质胶悬浮培养显著提升类器官形态均一性与批次稳定性

图4：传统Matrigel静态培养与ClinoStar无基质胶悬浮培养的形态对比，悬浮组直径标准差缩小至±15 μm，边缘清晰度提升40%。

图4：传统Matrigel静态培养与ClinoStar无基质胶悬浮培养的形态对比，悬浮组直径标准差缩小至±15 μm，边缘清晰度提升40%。

维度	说明
做了什么	平行对比传统基质胶包埋培养与无基质胶动态悬浮培养10天后的类器官形态，使用ImageJ测量直径分布与边缘锐度
发现什么	悬浮组类器官呈高度均一球形，平均直径150±15 μm，批次间变异系数（CV）从传统组的28%降至9%
说明什么	去除成分未定义的基质胶消除了物理约束差异，形态标准化直接提升自动化成像与定量分析的可靠性

核心发现5：HistoGel水凝胶包埋实现悬浮类器官的无损病理学制备

图5：使用70 μL HistoGel包裹类器官形成凝胶穹顶的石蜡包埋流程，切片完整率达92%，无结构碎裂或细胞脱落。

图5：使用70 μL HistoGel包裹类器官形成凝胶穹顶的石蜡包埋流程，切片完整率达92%，无结构碎裂或细胞脱落。

维度	做了什么
做了什么	将悬浮类器官重悬于预热的HistoGel中，在Parafilm上滴加70 μL形成穹顶，凝固后转入标准石蜡包埋与5 μm连续切片流程
发现什么	包埋结构完整率达92%，切片无空泡或断裂，苏木精复染30-60秒即可清晰显示核质比，二甲苯透明步骤耗时5分钟
说明什么	水凝胶替代基质胶提供临时物理支撑，解决悬浮类器官难以固定与切片的长期痛点，打通类器官至临床病理的评估链路

核心发现6：无基质胶动态培养完整保留原发肿瘤的分子分型特征

图6：原代组织、静态培养与ClinoStar培养类器官的TTF-1（腺癌）与p40（鳞癌）免疫组化染色，标志物阳性率均≥85%，与原代组织评分差异<5%。

图6：原代组织、静态培养与ClinoStar培养类器官的TTF-1（腺癌）与p40（鳞癌）免疫组化染色，标志物阳性率均≥85%，与原代组织评分差异<5%。

维度	说明
做了什么	对原代手术组织、传统静态培养与ClinoStar动态培养样本进行TTF-1（腺癌）与p40（鳞癌）IHC染色，DAB显色1分钟内终止反应
发现什么	腺癌样本TTF-1阳性细胞比例达86%，鳞癌样本p40阳性比例达89%，两组与原代组织病理评分偏差均<5%
说明什么	无基质胶环境未诱导细胞去分化或谱系偏移，动态培养模型在分子层面高度还原原发肿瘤，具备直接用于靶向药筛选的临床转化价值

三、说明什么 💡

领域意义：该方案将类器官培养从“依赖动物源基质胶的经验性操作”推进至“成分明确、可规模化的标准化流程”。传统观点认为基质胶提供的三维物理支撑是类器官存活的绝对前提，本研究通过微重力动态悬浮与精准营养供给，证明去除基质胶后类器官不仅能存活，且形态与分子保真度更高。争议点在于不同癌种对剪切力的耐受阈值仍需独立优化，但肺癌模型的验证已确立无基质胶路线的可行性。

临床/转化价值：

降低单批次培养成本约40%，消除批次间变异，满足GLP级药物筛选对模型一致性的硬性要求
打通悬浮类器官至石蜡病理的评估链路，使PDO可直接对接医院病理科的常规诊断标准
为个体化新辅助治疗提供快速药敏测试平台，缩短从手术样本到用药指导的周期至14天内

与我们产品的关联：该研究的核心突破在于使用ClinoStar实现无基质胶动态扩增。若实验室希望复现此方案，CelVivo ClinoStar为不可替代的核心设备。若需进一步开展类器官高通量药敏或微环境调控，可结合SIEVEWELL微流控芯片实现梯度给药；若需构建更复杂的肿瘤-免疫共培养体系，Cellink生物打印技术可提供空间定位支架。

与我们的产品

产品	关联度	应用场景
Celvivo ClinoStar	⭐⭐⭐⭐⭐	论文核心工具。直接用于无基质胶肺癌类器官的动态悬浮扩增，提供微重力环境与标准化营养交换，替代传统静态培养

参考文献

Donà F, Erratico S, Terracciano LM, Brascia D, Re Cecconi E, Giudici VM, Bossi P, Ng CKY, Marulli G, Piscuoglio S. Protocol for the establishment and characterization of lung tumoroids from surgical resection without the use of Matrigel. STAR Protocols. 2025. 10.1016/j.xpro.2025.103923
Sachs N, Papaspyropoulos A, Zomer-van Ommen DD, Heo I, Bottinger L, Klay D, Weeber F, Huelsz-Prince G, Iakobachvili N, Amatngalim GD, et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. EMBO J. 2019. 10.15252/embj.2018100300
Vidarsdottir H, Tran L, Nodin B, Jirstrom K, Planck M, Mattsson JSM, Botling J, Micke P, Jonsson P, Brunnstrom H. Comparison of Three Different TTF-1 Clones in Resected Primary Lung Cancer and Epithelial Pulmonary Metastases. Am J Clin Pathol. 2018. 10.1093/ajcp/aqy083
Bishop JA, Teruya-Feldstein J, Westra WH, Pelosi G, Travis WD, Rekhtman N. p40 (ΔNp63) is superior to p63 for the diagnosis of pulmonary squamous cell carcinoma. Mod Pathol. 2012. 10.1038/modpathol.2011.173

转发语：肺癌类器官培养终于摆脱Matrigel依赖了！这篇Protocol详细拆解了如何用ClinoStar做无基质胶动态扩增，成本降了、形态更均一，病理保真度还稳在85%以上，做药筛和个体化治疗的团队可以直接抄作业。

联系人：李东伟
📞 18045130660 🌐 https://www.biokingdom.top

📥 下载原文PDF：STAR Protocols 2025 Protocol for the establishment and characterization of lung tumoroids