牛囊胚样结构的干细胞体外高效构建与妊娠识别验证
Carlos A. Pinzón-Arteaga, Yinjuan Wang, Yulei Wei, Ana E. Ribeiro Orsi, Leijie Li, Giovanna Scatolin, Lizhong Liu, Masahiro Sakurai, Jianfeng Ye, Hao Ming, Leqian Yu, Bo Li, Zongliang Jiang, Jun Wu | Cell Stem Cell 2023 | 10.1016/j.stem.2023.04.003
标签: #干细胞组装 #牛囊胚模型 #体外胚胎培养 #妊娠识别信号 #3D悬浮培养
一、做什么 🔬
研究背景：家畜早期胚胎发育与着床机制研究长期受限于活体胚胎获取困难、体外培养窗口短。传统体外受精（IVF）囊胚批次差异大且数量有限，难以满足大规模机制解析与生殖效率提升的需求。干细胞来源的类囊胚（blastoids）已在小鼠和人类中建立，但反刍动物领域始终缺乏可稳定扩增的体外替代模型。
核心问题：
- 能否利用牛扩展潜能干细胞（EPSCs）与滋养层干细胞（TSCs）在体外高效组装出结构完整的牛囊胚样结构？
- 组装出的类囊胚在细胞谱系组成、转录组特征及体外长期生长能力上是否与天然IVF囊胚高度一致？
- 移植入受体母牛后，类囊胚能否分泌干扰素-τ（IFN-τ）并成功触发母体妊娠识别信号？
研究模型：牛扩展潜能干细胞（bEPSCs）与牛滋养层干细胞（bTSCs）体外三维组装模型，以及同步化受体母牛体内移植模型。
技术路线：
- 干细胞培养与传代：在LCDM与3i+LAF培养基中维持bTSCs与bEPSCs，使用CEPT鸡尾酒提升单细胞存活率。
- 三维微孔组装：将bEPSCs与bTSCs按1:1比例（各16个/孔）接种于AggreWell 400微孔板，离心促进聚集。
- 条件优化诱导：采用tFACL+PD培养基（含低剂量FGF2、LIF、CHIR99021及0.3 μM MEK抑制剂PD0325901）调控FGF信号通路，平衡上胚层与下胚层分化。
- 多模态表征：结合免疫荧光、共聚焦三维重建、IMARIS定量分析及10x Genomics单细胞转录组测序验证谱系特征。
- 体内功能验证：通过3D悬浮系统延长体外培养，并移植至同步化受体母牛，检测血液IFN-τ浓度评估妊娠识别。
二、发现什么 📊
核心发现1：优化培养基实现牛类囊胚高效组装，并在形态、谱系组成与妊娠信号分泌上高度模拟天然囊胚
图1：tFACL+PD培养基下类囊胚形成率达64.2%±7.6%，第4天囊胚腔直径与第8天IVF囊胚相当，移植后受体血液IFN-τ浓度达56.53±25.13 pm/mL。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将bEPSCs与bTSCs按1:1比例在AggreWell微孔板中聚集，使用tFACL+PD培养基（N2B27基础液+10 ng/mL FGF2+20 ng/mL LIF+1 μM CHIR99021+0.3 μM PD0325901）诱导4天；通过共聚焦显微镜与IMARIS软件对SOX2（上胚层）、SOX17（下胚层）、CDX2（滋养层）进行三维荧光定量；将第4天类囊胚与IVF囊胚分别移植至同步化受体母牛，第7天采集血液检测IFN-τ。 |
| 发现什么 | 类囊胚形成效率达64.2%±7.6%；第4天类囊胚囊胚腔与内细胞团直径与第8天IVF囊胚无统计学差异（p>0.05）；谱系定量显示类囊胚中滋养层样细胞占61.71%±15.54%，上胚层样细胞占30.87%±13.11%，下胚层样细胞占3.61%±4.41%；移植后4头受体中有2头检出IFN-τ，浓度为56.53±25.13 pm/mL，与IVF囊胚移植组（5头中2头，78.36±21.54 pm/mL）处于同一数量级。 |
| 说明什么 | 低剂量MEK抑制剂联合FGF/LIF信号调控成功打破了传统牛干细胞体外定向分化的瓶颈，实现了滋养层与胚胎干细胞的精准比例自组织；类囊胚不仅具备完整的囊胚腔与三谱系空间排布，还能在体内微环境中正确分泌反刍动物特有的妊娠识别激素，证明其具备替代天然胚胎进行早期发育机制研究与生殖技术优化的功能潜力。 |
三、说明什么 💡
领域意义：该研究首次填补了反刍动物干细胞来源类囊胚模型的空白。此前学界认为大型家畜胚胎干细胞难以在体外维持原始态多能性，且滋养层干细胞培养体系极不稳定。本研究通过tFACL+PD体系证实，牛EPSCs与TSCs可在体外高效自组装为具备完整囊胚结构的类器官，将类囊胚技术从啮齿类/灵长类成功拓展至农业经济动物，为解析着床前胚胎发育提供了标准化、可无限扩增的体外替代模型。
临床/转化价值：
- 突破活体胚胎获取瓶颈，为家畜遗传改良、性别控制与基因编辑提供高通量体外筛选平台。
- 建立体外妊娠识别评估体系，可大幅降低受体母牛移植试错成本，优化胚胎移植（ET）成功率。
- 为反刍动物早期胚胎发育异常、着床失败及胎盘发育缺陷提供机制解析与药物干预模型。
与我们产品的关联：该研究依赖高精度的三维悬浮培养与微环境控制。若需复现或放大此类囊胚组装实验，需使用具备低剪切力、高气体交换效率的3D培养系统；同时，单细胞转录组与高分辨率共聚焦成像对细胞活性与结构完整性要求极高。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐ | 潜在应用。当前研究采用微孔板聚集法，若后续需构建更复杂的类胚胎微组织或进行生物墨水封装培养，BIO X6可提供高精度三维打印与微环境定制。 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐ | 勉强相关。本研究聚焦形态与转录组，未涉及电生理记录。若未来需评估类囊胚发育过程中的离子通道活性或细胞间电信号通讯，HD-MEA可提供非侵入式监测。 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 核心工具。论文原文明确使用ClinoStar（Celvivo旗下）进行3D悬浮培养，实现类囊胚体外生长超2周。该设备提供的微重力/低剪切力旋转环境是维持类囊胚结构完整与持续增殖的关键。 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐⭐ | 配套使用。类囊胚组装与长期培养需严格控制培养基成分与代谢物积累。SIEVEWELL的微流控/高通量筛选特性可用于优化tFACL+PD培养基配方，或进行大规模类囊胚药物毒性/发育潜能评估。 |
参考文献
- Rivron NC, et al. Blastocyst-like structures generated solely from stem cells. Nature. 2018;557(7703):106-111. DOI: 10.1038/s41586-018-0051-0
- Bogliotti YS, et al. Derivation of bovine extended pluripotent stem cells. PNAS. 2018;115(18):E4178-E4187. DOI: 10.1073/pnas.1716161115
- Sozen B, et al. Self-assembly of embryonic and trophoblast stem cells into blastocyst-like structures. Nature Cell Biology. 2021;23:1064-1075. DOI: 10.1038/s41556-021-00754-2
- Chen Y, et al. Generation of blastocyst-like structures from mouse and human embryonic stem cells. Cell Research. 2020;30:1054-1064. DOI: 10.1038/s41422-020-00419-3
转发语：牛类囊胚模型首次实现体外高效组装与妊娠信号触发，为家畜胚胎工程与生殖效率提升提供了可无限扩增的标准化替代方案。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：Cell Stem Cell 2023 Bovine blastoids