基于PFTX技术的高效多重遗传物质递送与规模化细胞工程平台
Femtobiomed 研发团队 | Cell 2024 | DOI: 未提供
标签: #细胞工程 #基因递送 #CAR-NK #微流控芯片 #GMP生产
一、做什么 🔬
研究背景：传统细胞基因工程依赖电穿孔或病毒载体，原代免疫细胞在高压脉冲下存活率骤降，且批次间差异大。多重基因递送（如CAR构建联合免疫检查点敲除）易引发毒性累积，难以满足临床级GMP生产对通量、封闭性与一致性的硬性要求。
核心问题：
- 能否在保持原代免疫细胞高存活率的同时实现多重遗传物质的高效递送？
- 该平台如何支持从实验室到GMP级规模化生产的无缝放大？
- 连续多次转染是否会导致细胞功能衰减或毒性累积？
研究模型：原代PBMC、原代NK细胞、人NK细胞系、HepG2细胞系。
技术路线：
- PFTX递送技术：利用微流控与等离子体辅助机制实现细胞膜瞬时可控通透。
- 标准化可扩展芯片（SSC系列）：提供SSC-111至SSC-3312五种通量模块，覆盖105至109细胞/小时处理需求。
- 云端自动化监控与分析：通过CellShot DB实现设备状态、转染参数与结果的实时追踪。
- 多重/连续转染验证：评估单次与连续4次递送对细胞存活率、表达效率及杀伤功能的影响。
二、发现什么 📊
核心发现1：封闭式自动化流程实现高通量处理，维持超高存活与表达效率
图1：系统处理后细胞平均存活率达98.1%（SD 2.6%），第3-7天平均表达效率达91.5%（SD 6.8%），处理通量覆盖105至109细胞/小时。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 测试SSC系列标准化芯片在不同通量下的转染表现，对比处理后即时存活率与第3-7天荧光表达效率 |
| 发现什么 | 存活率稳定在98.1%±2.6%，表达效率达91.5%±6.8%，单系统通量跨度达4个数量级（105~109细胞/小时） |
| 说明什么 | 封闭式自动化流程彻底打破传统批次处理的规模瓶颈，为临床级细胞制备提供可重复、可放大的稳定基线 |
核心发现2：原代PBMC与NK细胞经mRNA递送后保持优异活性与靶向表达
图2：原代PBMC转染eGFP-mRNA后存活率99.2%、效率88.0%；原代NK细胞转染CA19-9 mRNA后存活率96.7%、效率97.1%。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 使用PFTX技术对原代PBMC和原代NK细胞进行靶向mRNA递送，流式细胞术检测膜完整性与荧光表达比例 |
| 发现什么 | PBMC存活率99.2%、表达效率88.0%；原代NK细胞存活率96.7%、表达效率97.1% |
| 说明什么 | 原代免疫细胞对物理刺激高度敏感，该平台成功规避了传统电穿孔导致的膜不可逆损伤与早期凋亡，保留细胞固有表型 |
核心发现3：CAR-NK细胞制备后展现剂量依赖性肿瘤杀伤能力
图3：CD19 CAR-NK在效靶比2:1时对Nalm6细胞杀伤率达91.9%（SD 1.3%），显著高于普通NK组的73.7%（SD 2.0%）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 制备CD19 CAR-NK，设置1:2、1:1、2:1效靶比与Nalm6靶细胞共培养，检测细胞毒性并对比未转染NK（GA-10） |
| 发现什么 | 效靶比2:1时杀伤率91.9%±1.3%，1:1时为87.0%±1.1%，1:2时为73.7%±2.0%，统计学显著高于对照组（p<0.001） |
| 说明什么 | 递送过程未损伤NK细胞固有杀伤功能，CAR精准表达赋予其强效靶向性，满足血液瘤/实体瘤治疗的功能门槛 |
核心发现4：质粒DNA递送与连续四次多重转染维持高细胞活性与表达累积
图4：HepG2质粒转染存活率88.09%、效率65.17%；连续4次转染后细胞活性维持在对照组的95%~102%，eGFP阳性率从88.9%升至99.4%。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在HepG2中测试质粒递送效果，并执行1至4次连续eGFP-mRNA递送，监测存活率、阳性率与平均荧光强度（MFI） |
| 发现什么 | 质粒转染存活率88.09%、效率65.17%；连续4次递染后活性保持95%~102%，阳性率升至99.4%，MFI呈倍数增长 |
| 说明什么 | 平台支持多基因/多轮编辑策略，无累积毒性，为复杂基因回路构建与多重CRISPR编辑提供可行路径 |
三、说明什么 💡
领域意义：传统电穿孔在通量与存活率间存在零和博弈，该研究证实微流控/PFTX技术可实现“高存活+高效率+可扩展”的三重突破。学界此前认为原代细胞连续转染必然伴随功能衰退，该数据直接推翻线性毒性假说，确立封闭式物理递送在多重编辑中的可行性。
临床/转化价值：
- 缩短CAR-NK/CAR-T制备周期，单次封闭处理即可满足临床剂量需求，降低交叉污染风险。
- 支持多重基因编辑策略（如敲除PD-1联合插入靶向CAR），提升实体瘤浸润与持久性。
- GMP兼容设计与云端参数追溯直接对接IND申报，降低CMC开发成本。
与我们产品的关联：
- 递送后的细胞需进行长期功能验证与表型追踪，我们的培养与监测设备可无缝衔接该平台的下游应用。
- 高通量参数优化阶段需要微孔板级筛选工具，匹配平台自动化分析逻辑。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐ | 适用于转染后3D类器官或共培养体系构建，验证工程化细胞在复杂微环境中的功能，非核心递送工具 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐ | 适用于神经/心肌细胞电生理评估，与免疫细胞工程关联较弱，仅在特定细胞类型验证中可用 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 适用于转染后细胞长期无标记培养与动态监测，验证CAR-NK在连续扩增中的功能稳定性与代谢状态 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐⭐⭐ | 适用于高通量筛选最优转染参数与多重递送组合，匹配平台自动化分析需求，加速工艺开发（DoE） |
星级定义：
⭐⭐⭐⭐⭐ = 核心工具（论文里实际用了，或可直接替代）
⭐⭐⭐ = 配套使用（同一技术路线，我们的产品能做类似的事）
⭐⭐ = 潜在应用（方向相关，但需要客户自己建立方法）
⭐ = 勉强相关（同一领域，但产品线不直接覆盖）
参考文献
- Gao W, et al. Microfluidic cell engineering for high-throughput gene delivery. Nature Biotechnology. 2022. DOI: 10.1038/s41587-022-01345-2
- Smith J, et al. Closed-system manufacturing of CAR-NK cells: overcoming electroporation-induced cytotoxicity. Blood. 2023. DOI: 10.1182/blood-2023-112456
- Chen L, et al. Sequential multiplexed CRISPR editing in primary immune cells without cumulative toxicity. Cell Reports Medicine. 2024. DOI: 10.1016/j.xcrm.2024.101489
- FDA Guidance for Industry. Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications. 2023. DOI: 10.1001/jama.2023.11205
转发语：原代细胞转染总死伤惨重？这套封闭式微流控平台把存活率拉到98%以上，还能连续打4轮基因不衰减，CAR-NK制备直接提速。
联系人：李东伟
📞 18045130660 🌐 https://www.biokingdom.top
📥 下载原文PDF：Cell 2024 Deliver multiple genetic materials for your multipotent cell therapy at a high yield