基于微流控纳米穿孔技术的高效多基因递送与CAR-NK细胞规模化制备
Femtobiomed 研发团队 | Cell 2024 | DOI: 未公开
标签: #细胞工程 #基因递送 #CAR-NK #微流控技术 #GMP生产
一、做什么 🔬
研究背景：传统电穿孔依赖高压脉冲击穿细胞膜，导致原代免疫细胞存活率普遍低于70%，且难以兼容多基因共递送；病毒载体虽效率高，但受限于包装容量、整合突变风险与GMP合规成本。细胞治疗产业化亟需一种兼顾高存活率、高转染效率与线性放大能力的非病毒递送平台。
核心问题：
- 能否在保持原代免疫细胞高存活率的同时实现多基因的高效递送？
- 微流控纳米穿孔工艺能否支持从实验室到GMP级生产的线性通量扩展？
- 经该系统制备的CAR-NK细胞是否具备稳定的剂量依赖性抗肿瘤杀伤活性？
研究模型：原代PBMC、原代NK细胞、HepG2细胞系、CD19 CAR-NK细胞系及Nalm6/GA-10肿瘤细胞系。
技术路线：
- 标准化微流控卡匣设计：采用SSC系列芯片，实现105至109 cells/h的线性通量扩展，适配不同生产规模。
- 多基因顺序递送验证：对细胞执行1至4轮连续eGFP-mRNA转染，评估累积效率与膜修复能力。
- 原代与工程化细胞功能评估：通过流式细胞术定量存活率、转染效率与MFI分布，结合共培养杀伤实验验证CAR-NK效应功能。
- 自动化闭环生产集成：搭载嵌入式操作系统与云端监控平台（CellShot DB），实现工艺参数远程调控与批次数据追溯。
二、发现什么 📊
核心发现1：原代PBMC mRNA递送实现超高存活率与转染效率
图1：原代PBMC经eGFP-mRNA单次转染后存活率达98.1%，第3-7天转染效率达91.5%
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 使用CellShot系统对原代PBMC进行eGFP-mRNA单次转染，设置DMSO溶剂对照，流式检测转染后即刻存活率与Day 3-7表达效率。 |
| 发现什么 | 转染后细胞存活率达98.1%（SD 2.6%），第3至7天转染效率达91.5%（SD 6.8%），流式直方图显示GFP阳性峰显著右移且分布集中。 |
| 说明什么 | 证明纳米穿孔在常压/低压下可实现温和物理穿孔，突破传统高压电穿孔的毒性瓶颈，为原代免疫细胞工程化提供高活性基础。 |
核心发现2：原代NK细胞工程化制备维持高活性与表型均一性
图2：原代NK细胞经CA19-9 mRNA工程化改造后存活率99.2%，转染效率88.0%
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 采用CA19-9 mRNA对原代NK细胞进行CAR工程化改造，Day 5采集样本进行流式分析，评估细胞状态与CAR表达水平。 |
| 发现什么 | 细胞存活率维持在99.2%（SD 6.4%），转染效率达88.0%，MFI分布呈单峰，未出现明显亚群丢失或碎片化。 |
| 说明什么 | 验证了系统对原代NK细胞的极低机械剪切损伤，确保工程化后细胞群表型均一，满足临床级细胞制剂的质控要求。 |
核心发现3：CAR-NK细胞展现剂量依赖性的高效肿瘤杀伤能力
图3：CD19 CAR-NK对Nalm6细胞的杀伤率随效靶比升高至91.9%，显著高于未修饰NK组
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将CD19 CAR-NK细胞与Nalm6（CD19+）及GA-10肿瘤细胞共培养，设置E:T比（1:2, 1:1, 2:1）进行3小时杀伤实验，以未修饰NK和肿瘤单培养为对照。 |
| 发现什么 | 针对Nalm6的杀伤率随E:T比升高呈线性增长，分别为73.7%（SD 2.0%）、87.0%（SD 1.1%）和91.9%（SD 1.3%）；对GA-10杀伤率显著高于对照组（p<0.001）。 |
| 说明什么 | 证实经该系统制备的CAR-NK保留完整效应功能，杀伤活性具备明确的剂量依赖性，可直接用于临床前药效学与安全性评价。 |
核心发现4：多轮顺序递送与质粒DNA转染验证系统兼容性与稳定性
图4：顺序递送4轮后存活率降至81.4%，但阳性率稳定在99.2%~99.3%，MFI随轮次累积上升
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对HepG2细胞进行6598 bp质粒DNA转染，并执行1至4轮eGFP-mRNA顺序递送，对比各轮次存活率、阳性率与MFI倍数。 |
| 发现什么 | 质粒转染存活率88.09%，效率65.17%；顺序递送4轮后存活率降至81.4%，但阳性率稳定在99.2%~99.3%，MFI随轮次累积上升。 |
| 说明什么 | 突破单次递送载荷限制，证明系统支持多基因/多载体顺序导入，适用于复杂细胞疗法（如双靶点CAR或逻辑门控回路）的构建。 |
三、说明什么 💡
领域意义：传统细胞工程高度依赖病毒载体或高压电穿孔，前者受限于监管审批与包装容量，后者导致原代细胞存活率断崖式下降。该研究证实微流控纳米穿孔可在低剪切力下实现可逆膜穿孔，将原代免疫细胞存活率推高至98%以上，同时保持>90%的递送效率。这为“无病毒、高通量、多基因”的细胞工程路线确立了新基准，推动行业从“实验室手工参数摸索”向“标准化GMP生产”过渡。
临床/转化价值：
- 缩短CAR-NK制备周期：非病毒mRNA递送避免基因组整合风险，符合监管机构对细胞治疗产品安全性的硬性要求。
- 支持复杂基因回路构建：顺序递送能力使多靶点CAR、安全开关或细胞因子共表达成为可能，提升实体瘤浸润与持久性。
- 降低商业化生产成本：线性放大的卡匣设计（105至109 cells/h）消除批次间差异，直接对接自动化细胞工厂。
与我们产品的关联：
- 下游功能验证环节需要高通量、低交叉污染的微环境模拟与实时监测设备。
- 细胞扩增与培养阶段需匹配低剪切力、高氧传递的3D悬浮体系，以承接递送后的高活性细胞群。
- 工艺开发与质控环节依赖自动化液体处理与多参数并行检测，形成“递送-培养-检测”数据闭环。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐ | 用于构建CAR-NK与肿瘤微环境共培养的3D类器官模型，验证递送后细胞在复杂基质中的浸润与杀伤动力学。 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐ | 主要用于神经元/心肌电生理记录，与免疫细胞杀伤通路关联较弱，暂不推荐作为核心配套。 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 提供低剪切力微重力悬浮培养环境，适用于CAR-NK递送后的扩增阶段，提升细胞扩增倍数并维持表型均一性。 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐⭐⭐ | 微孔阵列与自动化液体处理可无缝对接CellShot下游分选与功能验证，实现高通量杀伤实验、细胞因子分泌检测与工艺参数优化。 |
参考文献
- Zhang Y, et al. Scalable non-viral mRNA engineering of primary NK cells for cancer immunotherapy. Nature Communications. 2023. DOI: 10.1038/s41467-023-38912-1
- Wang L, et al. Microfluidic nanoporation for high-throughput cell engineering and multiplexed gene delivery. Lab on a Chip. 2022. DOI: 10.1039/D2LC00456A
- Liu X, et al. Sequential multiplexed gene delivery enables complex cell circuit construction in primary immune cells. Cell Reports Methods. 2024. DOI: 10.1016/j.crmeth.2024.100789
- Chen H, et al. GMP-compliant manufacturing of CAR-NK cells: challenges and technological solutions. Molecular Therapy. 2023. DOI: 10.1016/j.ymthe.2023.05.012
转发语：原代免疫细胞转染存活率破98%，还能连续递送4个基因不伤细胞。这套微流控递送方案把CAR-NK制备从“手工作坊”直接拉到GMP产线级别，做细胞治疗的朋友建议重点关注。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：Cell 2024 多基因递送与CAR-NK制备