无缓冲液分区流电穿孔技术实现原代细胞高效基因递送与CAR细胞制备
Femtobiomed 研发团队 | 技术白皮书 2024 | DOI: 暂无
标签: #分区流电穿孔 #原代细胞转染 #mRNA递送 #CAR-NK制备 #无缓冲液工艺
一、做什么 🔬
研究背景：传统电穿孔依赖专用缓冲液，细胞需经历离心洗涤与重悬混合。该流程导致机械应力损伤、细胞回收率下降，且脆弱核酸（如mRNA）在缓冲液中易降解。原代免疫细胞与干细胞对渗透压变化极度敏感，现有电转体系难以兼顾高存活率与高递送效率。
核心问题：
- 能否在细胞常规培养基中直接完成电穿孔，彻底取消洗涤与缓冲液替换步骤？
- 分区流电穿孔（PFEP）技术能否在封闭流体系统中实现核酸与细胞的独立进样与精准脉冲控制？
- 该无缓冲液工艺能否支持多轮连续递送，并满足GMP级细胞治疗生产的稳定性要求？
研究模型：原代人外周血单个核细胞（PBMC）、原代NK细胞、HepG2细胞系、CD19 CAR-NK细胞系。
技术路线：
- 分区流微流控芯片设计：细胞悬液与转染物料在独立流道并行输送，于微电极区交汇
- 无缓冲液直接电转：细胞保留在原始培养基中，避免渗透压骤变与离心损伤
- 自动化脉冲参数调控：0-2000 V电压与10-100 μs脉宽可编程匹配不同细胞类型
- 封闭式在线监控：集成云端数据库（CellShot DB）实时记录流速、脉冲日志与细胞状态
二、发现什么 📊
核心发现1：原代PBMC在常规培养基中直接转染eGFP-mRNA实现超90%存活率与表达效率
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将原代PBMC直接置于常规培养基中，通过PFEP系统递送eGFP-mRNA，不添加专用电转缓冲液，不进行离心洗涤，流式细胞术检测转染后第3至7天的存活率与GFP表达率 |
| 发现什么 | 细胞平均存活率为91.5%（标准差6.8%），GFP阳性细胞比例达98.1%（标准差2.6%），MFI分布呈单峰右移 |
| 说明什么 | 取消缓冲液替换步骤未引发渗透压休克，细胞膜修复能力完整，证明PFEP微流控脉冲对原代免疫细胞具有极低毒性，可直接用于mRNA递送 |
核心发现2：原代NK细胞经CA19-9 mRNA转染后高效制备CAR-NK并保持高杀伤活性
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 使用PFEP系统将CA19-9靶向CAR mRNA直接递送至原代NK细胞，培养5天后通过流式检测CAR表面表达率与细胞存活率，并与靶细胞Nalm6共孵育评估杀伤功能 |
| 发现什么 | 转染后第5天细胞平均存活率为97.1%（标准差1.4%），CAR阳性率达96.7%（标准差0%）；在效靶比2:1条件下，对Nalm6细胞的杀伤率达91.9%（标准差1.3%） |
| 说明什么 | 无缓冲液工艺完整保留了NK细胞受体活性与细胞毒性颗粒释放能力，CAR-NK制备周期缩短，杀伤效能优于未转染NK组（87.0%），验证了该路线在实体瘤靶向治疗中的可行性 |
核心发现3：质粒DNA在HepG2细胞中实现高转染效率与低毒性平衡
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将HepG2细胞与6598 bp环状质粒DNA（2036.32 kDa）混合后注入PFEP系统，在标准培养基中完成电穿孔，24小时后通过CCK-8检测细胞毒性，流式检测GFP阳性率 |
| 发现什么 | 细胞存活率为对照组的88.09%（标准差0.31%），转染效率达到65.17%（标准差0.57%） |
| 说明什么 | 大分子量环状DNA在分区流电场中未发生严重断裂，细胞膜穿孔尺寸与闭合时间匹配质粒内吞需求，证明该体系可兼容传统质粒载体，适用于稳转株构建与蛋白表达 |
核心发现4：连续多轮递送维持细胞高存活率与表达量累积
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对同一批细胞执行1至4轮顺序电转递送，每轮间隔固定恢复期，全程使用PFEP系统控制流速与脉冲，记录各轮次后的细胞存活率、GFP阳性比例及平均荧光强度（MFI） |
| 发现什么 | 第4轮转染后细胞存活率为对照组的81.4%102%，GFP阳性率从单次的88.9%提升至99.2%99.4%，MFI倍数呈阶梯式上升 |
| 说明什么 | 分区流设计避免了细胞反复离心与重悬造成的累积损伤，电场参数可动态补偿膜电位变化，支持多基因共递送或剂量爬坡实验，为复杂细胞工程提供稳定平台 |
三、说明什么 💡
领域意义：传统电穿孔工艺长期受限于缓冲液依赖性与开放操作带来的细胞损耗。该研究证实分区流电穿孔可在原生培养基中完成高效递送，将电转工艺从“缓冲液适配细胞”转变为“电场适配培养基”。学界对原代细胞电转存活率的认知阈值被推高至90%以上，封闭式微流控电转有望替代部分病毒载体与脂质体递送方案。
临床/转化价值：
- 缩短CAR-T/CAR-NK制备周期，取消洗涤步骤降低交叉污染风险，符合GMP封闭式生产规范
- 兼容mRNA、质粒、多肽等多种载荷，为个体化肿瘤疫苗与原位基因编辑提供标准化递送工具
- 自动化参数记录与云端监控支持工艺验证（Process Validation），加速IND申报数据生成
与我们产品的关联：该工艺核心在于电穿孔设备本身，下游需依赖细胞扩增、功能验证与高通量筛选。我们的仪器可无缝衔接PFEP转染后的细胞培养与表型分析环节，提供从基因递送到功能读数的完整工作流。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐ | PFEP转染后的原代NK/T细胞需快速扩增，BIO X6可用于构建3D免疫微环境，评估CAR细胞在类器官肿瘤模型中的浸润与杀伤动力学 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐ | 转染后CAR-NK的实时电生理活性与突触形成可通过HD-MEA进行无标记监测，补充传统杀伤实验的瞬时动态数据 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 封闭式微流控培养系统可直接对接PFEP出口，实现转染后细胞的连续灌流扩增与代谢物在线监测，满足GMP级细胞治疗生产需求 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐⭐ | 高通量微孔阵列可用于快速筛选PFEP最佳电压/脉宽参数组合，并行测试不同细胞系与核酸载荷的递送窗口，缩短工艺开发周期 |
参考文献
- Heller R, Jaroszeski MJ, Atkin A, et al. In vivo gene electrotransfer. Methods. 2002;28(2):188-195. DOI: 10.1016/S1046-2023(02)00258-9
- Kowalski PS, Rudolph A, Morsut RJ, et al. Delivering the message: Lipid nanoparticles for mRNA therapeutics. Cell. 2019;177(4):740-744. DOI: 10.1016/j.cell.2019.04.012
- Ghassemi S, Durgin JS, Nunez-Cruz S, et al. Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells. Nat Biomed Eng. 2022;6(2):118-128. DOI: 10.1038/s41551-021-00821-9
- Yarmush ML, Golberg A, Serša G, et al. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Annu Rev Biomed Eng. 2014;16:295-320. DOI: 10.1146/annurev-bioeng-071813-104622
转发语：电穿孔终于不用洗细胞换缓冲液了。原代NK直接培养基转染，存活率破90%，CAR表达近97%，封闭微流控+云端监控，细胞治疗工艺开发能省下一大半人工。
联系人：李东伟
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