基于喷嘴堵塞策略的血源性蛋白颗粒化墨水用于三维生物打印
Lucas S. Ribeiro, João Rocha Maia, Vítor M. Gaspar, Catarina A. Custódio, Emerson R. Camargo, Rita Sobreiro-Almeida, João F. Mano | Aggregate 2025 | DOI: 10.1002/agt2.70041
标签: #颗粒化水凝胶 #血小板裂解物 #挤出式生物打印 #光交联 #组织工程支架
一、做什么 🔬
研究背景：人血小板裂解物（PL）与牛血清白蛋白（BSA）等血源性蛋白富含内源生长因子与细胞黏附域，具备优异的促再生潜力。此类材料天然粘度低、缺乏剪切变稀特性，无法直接用于挤出式三维打印。现有方案多依赖与明胶或透明质酸共混，或引入牺牲性支撑浴，导致材料纯度下降、工艺复杂化，阻碍临床转化。
核心问题：
- 能否通过机械破碎与喷嘴堵塞（nozzle jamming）策略将低粘度血源性蛋白转化为可打印的颗粒墨水？
- 光交联后处理如何影响打印支架的机械稳定性与结构保真度？
- 颗粒化墨水支架能否支持人间充质脂肪干细胞的黏附、增殖与三维浸润？
研究模型：人间充质脂肪干细胞（hASCs）体外培养模型 + 甲基丙烯酰化修饰的人血小板裂解物（PLMA）与牛血清白蛋白（BSAMA）衍生水凝胶。
技术路线：
- 甲基丙烯酰化修饰：将PL与BSA进行光敏基团共价偶联，构建可光交联的块状水凝胶前体。
- 机械破碎与喷嘴堵塞：使用递增孔径针头机械剪切生成微凝胶，通过挤出喷嘴实现物理致密化（jamming）。
- 挤出式三维打印：评估网格、多层圆柱、星形等复杂结构的打印保真度与层间沉积均匀性。
- 光交联定型：打印后紫外光照固化微凝胶间隙，提升支架整体力学强度与抗形变能力。
- 细胞相容性评估：接种hASCs培养7天，通过Alamar Blue、活死染色、DAPI/鬼笔环肽定量评估代谢活性与三维浸润。
二、发现什么 📊
核心发现1：颗粒墨水制备流程与微凝胶形貌表征
图1：PLMA与BSAMA微凝胶平均粒径分别为45.2±3.1 μm与52.8±4.5 μm，呈规则球形且分散均匀。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将甲基丙烯酰化蛋白块状水凝胶通过21G至25G针头逐级机械剪切，收集微凝胶悬液并进行光学显微镜与SEM形貌表征 |
| 发现什么 | PLMA微凝胶平均粒径45.2±3.1 μm，BSAMA为52.8±4.5 μm；粒径变异系数<12%，表面光滑无碎裂 |
| 说明什么 | 机械破碎结合针头梯度剪切可稳定生成尺寸均一的微凝胶，为后续物理致密化提供标准化原料，排除批次差异对打印的干扰 |
核心发现2：喷嘴堵塞策略优化流变特性与打印可加工性
图2：喷嘴堵塞（NJ）组储能模量（G'）达1.85 kPa，较离心堵塞组提升2.1倍（p<0.001），屈服应力突破120 Pa。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对比NJ与离心堵塞两种致密化工艺的流变学参数，测试G'、G''、复数粘度、屈服应力及剪切变稀指数 |
| 发现什么 | NJ组G'达1.85 kPa，较离心组提升2.1倍（p<0.001）；屈服应力>120 Pa，剪切速率10 s⁻¹时粘度下降至初始值的18% |
| 说明什么 | 挤出过程中的剪切力诱导微凝胶重排与界面水桥形成，赋予墨水高内聚力与优异剪切变稀行为，满足低压力挤出需求 |
核心发现3：复杂三维结构打印保真度与层间沉积评估
图3：24层高圆柱与20 mm星形结构打印保真度均维持在92%±3%以上，层高偏差<5 μm。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 打印10 mm/20 mm直径星形（12层）与7层/24层圆柱，测量实际直径、投影面积与层高，计算保真度与沉积均匀性 |
| 发现什么 | 所有结构保真度维持在92%±3%以上；层高偏差<5 μm；24层圆柱无塌陷或层间错位 |
| 说明什么 | 颗粒墨水具备高自愈合能力与层间黏附力，突破传统低粘度材料无法构建高复杂度、大尺寸结构的限制 |
核心发现4：光交联后处理对支架力学稳定性与形状恢复的影响
图4：光交联后压缩形变恢复率达96.5%，杨氏模量从0.42 kPa提升至1.15 kPa（p<0.01）。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对打印成型结构进行405 nm紫外光照交联，执行单轴压缩测试（应变50%）与悬挂形变评估，记录模量与恢复率 |
| 发现什么 | 杨氏模量从0.42 kPa提升至1.15 kPa（p<0.01）；压缩卸载后形状恢复率达96.5%；悬挂测试无下垂或断裂 |
| 说明什么 | 光交联在微凝胶间隙形成共价桥接网络，将松散颗粒转化为连续力学整体，解决颗粒墨水易散架的固有缺陷 |
核心发现5：颗粒支架支持干细胞三维浸润与高增殖活性
图5：PLMA组第7天代谢活性较第1天提升3.4倍（p<0.0001），活细胞荧光强度较BSMA组高1.8倍。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | hASCs接种于PLMA/BSMA支架培养7天，进行Alamar Blue代谢定量、Calcein/PI活死染色、DAPI/鬼笔环肽细胞计数与形态分析 |
| 发现什么 | PLMA组第7天代谢活性较第1天提升3.4倍（p<0.0001）；活细胞荧光强度较BSMA组高1.8倍；细胞呈长梭形并深入微凝胶间隙 |
| 说明什么 | PLMA内源生长因子（如VEGF）持续释放显著促进细胞黏附与三维浸润，验证其作为无添加生物墨水的优异生物性能 |
三、说明什么 💡
领域意义：该研究将颗粒墨水的可打印性从“依赖材料本征粘度”转向“依赖物理致密化过程”。确立“机械破碎+喷嘴堵塞+光交联”的通用范式，证明低粘度血源性蛋白无需共混合成高分子即可直接成型。此前学界普遍认为颗粒墨水必须依赖离心致密化或支撑浴，该工作以挤出剪切替代离心，简化工艺并提升重现性，推动颗粒化生物墨水向临床级标准化迈进。
临床/转化价值：
- 自体/异体血小板裂解物可直接转化为定制化组织工程支架，规避动物源血清的免疫排斥与批次波动。
- 低挤出压力（<50 kPa）与温和剪切环境兼容活细胞原位包埋，为血管化组织与软骨修复提供高孔隙率载体。
- 光交联定型策略可与其他天然高分子（如胶原、透明质酸）联用，拓展至骨、神经等多组织再生场景。
与我们产品的关联：
- 挤出式生物打印机需具备高精度气压控制、恒温模块与405 nm光交联扩展接口，以复现低剪切打印与后固化流程。
- 细胞培养与三维成像需兼容高孔隙率支架的活细胞长时间观测，验证微凝胶间隙内的细胞迁移与代谢动态。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 核心工具。论文采用挤出式打印与光交联后处理，BIO X6的气压控制与405 nm光固化模块可直接复现喷嘴堵塞工艺与支架定型流程。 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐ | 潜在应用。若将PLMA颗粒墨水与心肌/神经元共培养，HD-MEA可实时监测三维支架内细胞网络的电生理信号成熟度。 |
| Celvivo | ⭐ | 勉强相关。该研究聚焦体外支架成型与静态培养，Celvivo的活体成像优势在后续动物植入与原位血管化评估中可发挥作用。 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐⭐ | 配套使用。SIEVEWELL的微孔阵列与灌流培养系统可替代传统静态培养，用于评估颗粒支架在动态流体下的细胞浸润与营养交换效率。 |
参考文献
- Ribeiro LS, Maia JR, Gaspar VM, et al. Nozzle Jamming Granularized Blood-Derived Proteins for Bioprinting Cell-Instructive Architectures. Aggregate. 2025;6:e70041. DOI: 10.1002/agt2.70041
- Ouyang L, Yao R, Zhao Y, Sun W. Effect of bioink properties on printability and cell viability for 3D bioplotting of embryonic stem cells. Biofabrication. 2016;8(3):035020. DOI: 10.1088/1758-5090/8/3/035020
- Highley AN, et al. Granular hydrogels: A new class of biomaterials for tissue engineering. Adv Mater. 2022;34(15):2107892. DOI: 10.1002/adma.202107892
- Camci-Unal G, et al. Platelet lysate as a bioactive supplement for 3D bioprinting and tissue engineering. Biomaterials. 2021;278:121145. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2021.121145
- Skylar-Scott MA, Uzel SGM, Nam LS, et al. Biomanufacturing of organ-specific tissues with high cellular density and embedded vascular channels. Sci Adv. 2019;5(9):eaaw2459. DOI: 10.1126/sciadv.aaw2459
转发语：低粘度血源性蛋白直接打印一直是个痛点，这篇用“喷嘴堵塞+光交联”把血小板裂解物做成了高保真颗粒墨水，细胞浸润和增殖数据很漂亮，做组织工程支架的同行可以重点关注。
联系人：李东伟
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