双纳米纤维与氧化石墨烯协同增强3D打印仿生骨修复支架
Elena Cojocaru, Mădălina Oprea, George Mihail Vlăsceanu, Mădălina-Cristina Nicolae, Roxana-Cristina Popescu, Paul-Emil Mereuță, Alin-Georgian Toader, Mariana Ioniță | RSC Advances 2024 | DOI: 10.1039/d4ra06167e
标签: #3D生物打印 #骨组织工程 #水凝胶流变学 #石墨烯复合材料 #仿生支架
一、做什么 🔬
研究背景：临床大段骨缺损（>2 cm）修复长期依赖自体或异体骨移植，供体短缺与免疫排斥风险限制其广泛应用。海藻酸钙水凝胶具备优异生物相容性与FDA认证背景，但生理环境下力学强度不足、降解过快，且缺乏天然骨细胞外基质（ECM）特有的各向异性力学梯度，难以有效引导成骨细胞定向迁移与矿化沉积。
核心问题：
- 能否通过静电纺丝纳米纤维与氧化石墨烯的双重填充，构建具有仿生各向异性的海藻酸钙复合支架？
- 氧化石墨烯浓度如何调控墨水流变特性与挤出打印保真度？
- 该多尺度复合支架能否在体外有效促进成骨细胞增殖与羟基磷灰石矿化？
研究模型：MG-63成骨细胞 + 海藻酸钙/纤维素纳米纤维(CNF)/壳聚糖-PEO纳米纤维(NF)/氧化石墨烯(GO) 3D打印复合支架。
技术路线：
- 流变学表征：测定剪切变稀行为、储能模量(G')与损耗角正切(tanδ)，拟合Herschel-Bulkley模型筛选最佳GO浓度。
- 挤出式3D打印：使用Cellink BIO X6优化气压与打印速度，计算打印指数(Pr)、膨胀率(a)与均匀度因子(U)。
- 多模态形貌与力学分析：结合SEM、微CT与纳米压痕技术，量化内部孔隙分布、纤维致密域(FDD)占比及局部弹性/黏性模量。
- 体外成骨评估：通过LDH、MTT与茜素红染色，系统验证细胞毒性、增殖动力学与矿化能力。
二、发现什么 📊
核心发现1：0.1% GO浓度触发最优流变网络，赋予墨水理想剪切变稀特性与固态凝胶行为
图1：0.1% GO添加使墨水储能模量(G')较纯海藻酸钙组提升约100倍，损耗角正切(tanδ)降至0.174，线性黏弹区(LVR)显著拓宽。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 使用Kinexus Pro流变仪在0.01-1000 s⁻¹剪切速率下测定黏度与G'/G''，进行振幅与频率扫描，拟合Herschel-Bulkley模型提取流动行为指数(n)与屈服应力(σ₀) |
| 发现什么 | ACNG-0.1组n=0.28，σ₀=0 Pa，G'在低频区稳定高于G''，tanδ=0.174，LVR区间最宽；GO浓度升至0.5%时n回升至0.22，G'下降 |
| 说明什么 | 0.1% GO促使聚合物链与GO片层间形成最强氢键网络，实现理想的剪切变稀与固态支撑特性；浓度过高引发GO团聚破坏网络连续性，排除线性剂量增强假说 |
核心发现2：GO浓度超过0.2%导致挤出断裂，0.1%为兼顾流变与打印精度的临界阈值
图2：纯AC组打印指数(Pr)最高(1.03±0.04)，ACNG-0.1组维持0.96±0.03，GO浓度升至0.5%时Pr骤降至0.71±0.03并伴随挤出断裂。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 打印10×10×3 mm网格结构，ImageJ计算Pr指数、丝线膨胀率(a)与均匀度因子(U)，对比离子交联前后形貌变化 |
| 发现什么 | AC组Pr=1.03±0.04，ACNG-0.1组Pr=0.96±0.03且丝线连续；ACNG-0.5组Pr=0.71±0.03，膨胀率a异常升高，U值显著下降(p<0.001) |
| 说明什么 | 低浓度GO均匀分散可维持结构保真度，超过0.2%后GO片层发生宏观团聚，破坏挤出连续性，证实流变预测与实际打印行为高度一致 |
核心发现3：多尺度填料重构表面拓扑结构，适度降低孔隙率提升力学支撑性
图3：添加CNF与NF使支架表面粗糙度显著增加，0.1% GO组孔隙壁面致密化，>0.2% GO组表面出现随机碳质团聚体。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 冻干支架喷金处理，15 kV背散射电子模式采集顶视、表面与截面SEM图像，对比不同填料组合的微观形貌 |
| 发现什么 | ACN组呈现折叠片层状形貌，ACNG-0.1组孔壁厚度均匀(~14 μm)且表面微粗糙；ACNG-0.2/0.5组表面可见明显GO团聚颗粒 |
| 说明什么 | 壳聚糖氨基与海藻酸羧基静电作用结合氢键重构聚合物网络，适度降低孔隙率可提升力学支撑性，GO团聚直接导致微观结构缺陷 |
核心发现4：亚微米级纤维致密域(FDD)相干组装，形成力学各向异性与营养扩散通道的最优平衡
图4：总孔隙率(T.Po)在72%~89%区间波动，ACNG-0.1组FDD占比仅1.7%，但形成贯穿性力学传导网络。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 50 kV微CT扫描冻干样品，CT-NRecon重建3D模型，阈值分割提取FDD与基体相，计算孔径/壁厚分布与体积占比 |
| 发现什么 | AC组T.Po最高达89%，ACNG-0.2组最低为72%；ACNG-0.1组中值孔径/壁厚为15.1/12.6 μm，FDD/BC体积比1.7% |
| 说明什么 | 0.1% GO促使填料在亚微米尺度发生相干组装，调控冷冻干燥相分离过程，在维持高孔隙率的同时建立定向力学传导路径 |
核心发现5：离子交联与物理阻隔协同作用，实现高吸水膨胀与可控降解速率
图5：复合支架在PBS中72小时达到最大溶胀度(MSD)约820%，14天降解率(DD)控制在32.4%以内，FTIR证实-COO⁻与-NH₃⁺静电交联。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | FTIR扫描4000-600 cm⁻¹特征峰，37℃ PBS中定时称重计算溶胀度与降解率，对比不同组别的水合与质量损失动力学 |
| 发现什么 | ACNG-0.1组1540 cm⁻¹处出现酰胺II带位移，MSD稳定在820%±45%，14天DD为32.4%±3.1% |
| 说明什么 | 壳聚糖氨基与海藻酸羧基形成稳定离子交联网络，GO片层物理阻隔延缓水分子渗透，使支架在生理环境中兼具高吸水能力与匹配骨再生周期的降解速率 |
核心发现6：GO/纳米纤维拓扑结构协同激活成骨通路，显著加速羟基磷灰石沉积
图6：MG-63细胞在ACNG-0.1支架上培养14天存活率达102%±5%，LDH释放率<4%，茜素红定量显示钙沉积量较对照组提升1.9倍(p<0.01)。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | MG-63细胞接种于支架，4/7/14天进行MTT代谢活性检测、LDH细胞毒性测定与茜素红矿化染色定量(405 nm吸光度) |
| 发现什么 | 14天MTT吸光度为对照组的1.02±0.05倍，LDH释放量<4%，茜素红405 nm吸光度值达对照组的1.9±0.12倍 |
| 说明什么 | 双增强体系无细胞毒性，GO表面含氧官能团与纳米纤维拓扑结构协同提供黏附位点与力学信号，显著上调成骨分化与矿化沉积效率 |
三、说明什么 💡
领域意义：传统海藻酸钙支架因力学薄弱与结构均一，难以模拟天然骨ECM的梯度刚度与纤维取向。该研究确立“流变调控-双重填料-3D打印”范式，证明0.1% GO与静电纺丝纳米纤维的协同作用可精准构建亚微米级力学各向异性网络，将水凝胶支架从“被动填充物”推向“主动力学信号传导平台”。学界此前多聚焦单一填料增强，该工作明确了多尺度填料在亚微米相干组装中的阈值效应，为仿生支架设计提供定量流变-结构映射关系。
临床/转化价值：
- 定制化骨缺损修复：基于患者CT数据直接打印匹配解剖曲率的梯度刚度植入体，缩短手术适配周期。
- 促骨整合涂层开发：GO/纳米纤维复合墨水可作为钛合金或PEEK植入体表面生物活性涂层，加速早期骨愈合与界面整合。
- 体外骨类器官模型：高保真仿生支架为抗骨质疏松药物筛选提供接近体内微环境的3D测试平台，降低动物实验依赖。
与我们产品的关联：论文直接使用Cellink BIO X6完成多组分墨水挤出成型。若需进一步评估支架力学信号对细胞骨架重排的影响，可引入3Brain HD-MEA记录成骨细胞在动态培养中的电生理响应；Celvivo微流控芯片可搭载该支架进行动态灌注培养，模拟骨组织微环境下的营养交换与剪切力刺激，验证长期结构稳定性。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 论文核心设备，直接用于多组分墨水挤出成型、气压/速度参数优化与网格结构打印 |
参考文献
- Cojocaru E, Oprea M, Vlăsceanu GM, et al. Dual nanofiber and graphene reinforcement of 3D printed biomimetic supports for bone tissue repair. RSC Adv. 2024;14:32517-32532. DOI: 10.1039/d4ra06167e
- Gungor-Ozkerim PS, Inci I, Zhang YS, et al. Bioinks for 3D bioprinting: an overview. Biomater Sci. 2018;6:915-946. DOI: 10.1039/C7BM00765E
- Shin SR, Bae H, Cha JM, et al. Graphene oxide-based hydrogels for tissue engineering. Adv Mater. 2012;24:5020-5026. DOI: 10.1002/adma.201201863
- O'Brien FJ. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Mater Today. 2011;14:88-95. DOI: 10.1016/S1369-7021(11)70058-X
转发语：海藻酸钙支架太软？这篇RSC Advances用0.1%氧化石墨烯+静电纺丝纳米纤维双管齐下，把流变、打印保真度和成骨矿化效率一次性拉满，3D打印骨修复支架的配方阈值终于有了定量答案。
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