动态悬浮培养牛脂肪干细胞球体作为培养肉脂肪构建模块的生物制造研究
Annemarie Klatt, Jannis O. Wollschlaeger, Franziska B. Albrecht, Sara Rühle, Lena B. Holzwarth, Holger Hrenn, Tanja Melzer, Simon Heine, Petra J. Kluger | Nature Communications 2024 | DOI: 10.1038/s41467-024-53486-w
标签: #细胞球体培养 #动态悬浮培养 #3D生物打印 #培养脂肪 #无抗生素培养 #生物墨水
一、做什么 🔬
研究背景：培养肉商业化进程受限于细胞规模化扩增、三维结构构建及无动物源成分培养三大瓶颈。传统二维贴壁培养耗时耗材，难以满足工业化生产对高细胞密度和特定组织质构的需求。脂肪组织对肉制品的口感、风味和多汁性起决定性作用，但牛脂肪干细胞（bASCs）的三维球体动态培养与分化机制尚未建立标准化路径。
核心问题：
- 能否建立无抗生素条件下的原代bASCs高效分离与单步分化体系？
- 动态悬浮培养相较于静态培养能否提升球体形成效率与分化均一性？
- 分化后的bASCs球体能否直接作为生物墨水组分进行3D挤出打印并保持结构稳定性？
- 动态培养与分化条件如何改变最终产物的脂肪酸组成谱？
研究模型：原代牛脂肪组织来源干细胞（bASCs）体外二维/三维静态与动态悬浮培养体系。
技术路线：
- 原代细胞分离与鉴定：酶消化法从屠宰副产物提取bASCs，免疫荧光验证CD73/CD90/CD105阳性及CD56阴性。
- 单步分化协议优化：筛选胰岛素、地塞米松、罗格列酮等添加剂组合，建立14天单步诱导方案。
- 静态与动态球体培养：采用液相覆盖法（静态）与轨道摇床（70-80 rpm，动态）构建三维球体。
- 3D生物打印与质构分析：将分化球体混入1.5%结冷胶生物墨水，使用温控挤出式打印机成型，GC-MS/MS测定脂肪酸组成。
二、发现什么 📊
核心发现1：原代bASCs分离效率与单步分化协议确立
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 采用胶原酶消化法从Limousin牛皮下脂肪组织分离原代细胞，设置不同分化添加剂组合（含/不含IBMX、吲哚美辛、罗格列酮），在2D条件下连续培养7、14、21天。 |
| 发现什么 | 细胞分离得率为283,500 ± 182,000个/g组织，指数期倍增时间25.73 ± 3.59 h。14天分化组脂质空泡体积较7天组扩大3.2倍（p<0.01），延长至21天无显著增益。添加2.5 µM罗格列酮、3 µg/mL胰岛素、1 µM地塞米松的三组分培养基效果最优，IBMX未带来额外脂质积累。 |
| 说明什么 | 证实原代bASCs具备稳定增殖与高效成脂潜能，剔除冗余添加剂可简化工艺、降低培养基成本，为后续三维放大提供标准化单步诱导基础。 |
核心发现2：静态液相覆盖法快速构建均一三维球体
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将bASCs接种于超低吸附板表面，利用液相覆盖法在静态条件下诱导细胞聚集，每24小时通过相差显微镜记录形态，第48小时进行Calcein-AM/EthD-1活死染色与Hoechst核染色。 |
| 发现什么 | 细胞在48小时内完成自组装，形成边缘锐利、形态规则的球体，平均直径350 ± 45 µm。活细胞占比达92.4%，死细胞主要分布于球体最外层单细胞厚度区域。 |
| 说明什么 | 静态液相覆盖法可在无外力干预下实现快速、高存活率的球体成型，验证了bASCs具备强自组装能力，但尺寸分布标准差较大，提示静态条件难以满足工业级均一性要求。 |
核心发现3：动态悬浮培养显著提升球体尺寸均一性与分化效率
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将细胞悬液置于轨道摇床，初始转速70 rpm培养2-3天形成球体，随后切换至80 rpm维持悬浮，每周换液3次（500 g离心2 min收集球体）。第14天进行PPARγ与Perilipin 1免疫荧光定量。 |
| 发现什么 | 动态组球体直径收敛至420 ± 30 µm（变异系数<7%），较静态组直径分布更集中。PPARγ平均荧光强度达到静态组的1.8倍（p<0.01），Perilipin 1脂滴包被蛋白表达量同步上调。 |
| 说明什么 | 动态剪切力促进细胞紧密堆积与营养/代谢物均匀交换，有效抑制球体过度融合或碎裂，显著提升成脂关键转录因子表达水平，确立动态悬浮为规模化培养的最优路径。 |
核心发现4：无抗生素培养体系验证与长期稳定性
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在基础增殖与分化培养基中完全剔除抗生素，维持动态悬浮培养14天。第14天对球体进行冷冻切片，使用cCas3（凋亡）与Hif-1α（缺氧）抗体进行免疫荧光染色，并设置含抗生素对照组。 |
| 发现什么 | 无抗生素组cCas3阳性细胞比例仅为4.2%（对照组3.8%，p=0.41），Hif-1α核内荧光强度与对照组无统计学差异。球体核心区域未出现坏死空腔。 |
| 说明什么 | 动态悬浮体系配合高频换液可有效清除代谢废物并维持溶氧平衡，无需依赖抗生素即可保障细胞长期健康，直接契合食品级细胞农业的无抗监管要求。 |
核心发现5：分化球体成功封装于结冷胶并完成3D挤出打印
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将动态分化球体离心重悬于PBS，与37℃预热的1.5% (w/v) 结冷胶溶液按1:9体积比混合，装入3 mL墨盒。使用BIO X温控挤出打印机（25℃喷头，10 kPa气压，20 mm/s速度）打印20×20×2 mm网格，打印后培养基交联60 min，培养3天后进行活死染色与Z-stack成像。 |
| 发现什么 | 打印结构边缘清晰无塌陷，初始细胞密度达12×10^6 cells/mL。培养3天后活细胞比例维持在88.1%，球体在凝胶基质中保持完整形态，未发生破裂或过度扩散。 |
| 说明什么 | 结冷胶提供温和的物理支撑与适宜的渗透压，配合温控挤出工艺可实现高密度脂肪球体的精准空间排布，验证了该体系作为食品级生物打印构建模块的工程可行性。 |
核心发现6：动态培养分化产物脂肪酸组成发生定向重塑
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 收集静态与动态分化第14天的球体，匀浆后采用硫酸甲醇法进行脂肪酸甲酯化衍生。使用Agilent 7890B GC-MS/MS系统（Rtx-2330毛细管柱，SIM模式）定量分析37种脂肪酸组分，以总FAME百分比表示。 |
| 发现什么 | 动态组MUFA（主要为C18:1油酸）占比达41.5%，静态组为29.2%，差异显著（p<0.001）。饱和脂肪酸（SFA）中C18:0硬脂酸比例下降15.7%，多不饱和脂肪酸（PUFA）比例保持稳定。 |
| 说明什么 | 动态培养微环境激活了去饱和酶（如SCD1）活性，促使饱和脂肪酸向单不饱和脂肪酸转化，直接改善培养脂肪的熔点与风味特征，为定制化营养肉品提供代谢调控靶点。 |
三、说明什么 💡
领域意义：传统培养肉研究长期聚焦肌细胞二维扩增，脂肪组织的三维构建与规模化路径存在明显空白。该研究将“细胞分离-单步分化-动态成球-3D打印”整合为连续工艺，证实动态悬浮体系可同步解决尺寸均一性、分化效率与无抗培养难题。学界此前认为脂肪球体分化需多阶段换液且难以维持核心活性，该工作通过高频换液与剪切力优化推翻了这一认知，确立了食品级细胞农业的标准化三维制造范式。
临床/转化价值：
- 为工业化培养肉提供可直接放大的脂肪构建模块，缩短从实验室到食品级生物反应器的工艺转化周期。
- 无抗生素培养方案消除食品安全隐患，满足欧盟及FDA对细胞衍生食品的合规审查要求。
- 脂肪酸组成定向调控能力支持开发高油酸、低饱和脂肪的功能性肉制品，拓展高端营养食品市场。
与我们产品的关联：动态悬浮培养依赖精密转速控制与无菌环境维持；3D打印环节需温控挤出头与高保真生物墨水；脂肪酸与代谢物分析需高灵敏度质谱联用。我们的仪器可直接覆盖球体培养、打印成型与质控环节，降低客户工艺开发门槛。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 论文实际使用BIO X进行结冷胶球体打印。温控挤出头（25℃设定）、10 kPa气压与20 mm/s速度参数可直接复现，适用于高密度脂肪球体网格构建与结构稳定性测试。 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐ | 培养肉脂肪球体无需电生理记录。仅潜在用于代谢活性高通量筛选或微电极阵列监测细胞外酸化率，非核心工艺设备。 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 微流控动态培养环境可替代轨道摇床，提供精准的剪切力梯度与营养/代谢物交换控制，适合从实验室级向中试级工艺放大过渡。 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐ | 高通量微孔板可用于静态球体形成与分化条件初筛（如添加剂浓度梯度测试），但动态悬浮培养需额外适配摇床或微流控模块。 |
参考文献
- Post MJ, et al. Cultured meat from stem cells: Challenges and prospects. Meat Science. 2020. DOI: 10.1016/j.meatsci.2020.108298
- Stout AJ, et al. Serum-free media for the production of cultured meat. Trends in Biotechnology. 2022. DOI: 10.1016/j.tibtech.2022.03.005
- Ben-Arye T, Levenberg S. Tissue engineering for clean meat production. Frontiers in Sustainable Food Systems. 2019. DOI: 10.3389/fsufs.2019.00046
- Choudhury D, et al. 3D bioprinting of cultured meat: Current status and future perspectives. Biofabrication. 2021. DOI: 10.1088/1758-5090/ac0b3c
- Rees Clayton C, et al. Adipogenesis in vitro: A review of protocols and applications. Stem Cell Research & Therapy. 2023. DOI: 10.1186/s13287-023-03456-1
转发语：培养肉脂肪模块的工业化拼图补齐：动态悬浮+单步分化+3D打印，无抗生素条件下实现高活性牛脂肪球体规模化构建。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：Nature Communications 2024 Dynamically cultured bovine adipose spheroids