3D打印上转换纳米粒子掺杂气凝胶作为可荧光追踪的诊疗植入物
Ana Iglesias-Mejuto, Rui Pinto, Pedro Faísca, José Catarino, João Rocha, Luisa Durães, Maria Manuela Gaspar, Catarina Pinto Reis, Carlos A. García-González | Bioactive Materials 2024 | 10.1016/j.bioactmat.2024.07.033
标签: #3D生物打印 #气凝胶支架 #上转换纳米粒子 #近红外荧光成像 #组织工程 #诊疗一体化
一、做什么 🔬
研究背景：组织工程支架植入体内后，其降解动力学、空间位置及与宿主组织的整合过程长期处于“黑盒”状态。传统荧光探针受限于组织穿透深度浅（仅数毫米）、易光漂白及背景自荧光干扰，难以实现长期无损监测。上转换纳米粒子（UCNPs）具备近红外激发、抗光淬灭及窄发射峰特性，但将其稳定整合至3D打印多孔支架并验证其体内长效追踪能力，仍缺乏系统性实验支撑。
核心问题：
- 能否将高荧光UCNPs均匀负载于3D打印海藻酸盐-羟基磷灰石生物墨水中，并在超临界CO₂干燥后维持双孔气凝胶结构？
- 负载UCNPs的气凝胶在体外细胞增殖、迁移、血液相容性及体内免疫应答中是否保持生物安全性？
- 该复合支架能否在近红外荧光成像下实现植入后长达数周的体内实时、无损追踪？
研究模型：3D打印海藻酸盐/羟基磷灰石气凝胶支架（体外BALB/c 3T3成纤维细胞、间充质干细胞、人全血、鸡胚CAM；体内小鼠/大鼠皮下植入模型）。
技术路线：
- 流变调控与3D打印：配制含不同浓度UCNPs的生物墨水，通过幂律模型拟合剪切变稀系数，挤出打印定制几何形状。
- 超临界CO₂干燥与灭菌：将水凝胶前体经scCO₂脱水转化为高孔隙率气凝胶，同步完成终端灭菌。
- 多模态理化表征：氮气吸脱附测定比表面积与孔径分布，SEM/TEM/共聚焦显微镜解析UCNPs空间分布及3年储存稳定性。
- 体外/体内生物安全性评价：WST-1细胞活力、划痕迁移、溶血试验、HET-CAM试验，皮下植入后检测血浆TNF-α/IL-6/IL-10及主要脏器组织指数。
- 活体近红外荧光成像：小鼠皮下植入后，利用活体成像系统连续采集荧光信号至术后第21天。
二、发现什么 📊
核心发现1：UCNPs负载生物墨水具备优异剪切变稀特性与高保真3D打印成型能力
图1：Alg UCNPs 0.8配方剪切变稀系数b值为552.8 Pa·s，c值为3.9×10⁻⁸，打印结构边缘锐利且宏观荧光强度随UCNPs浓度线性增强。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 配制海藻酸盐/羟基磷灰石/UCNPs生物墨水，采用旋转流变仪测定剪切速率-黏度曲线，拟合幂律模型参数；进行3D挤出打印并测量几何保真度与宏观荧光分布。 |
| 发现什么 | Alg UCNPs 0.8组剪切变稀系数b=552.8 Pa·s，c=3.9×10⁻⁸；打印结构尺寸偏差<5%，宏观荧光强度与UCNPs添加量呈正相关（0.4 mg/mL至0.8 mg/mL荧光强度提升约1.8倍）。 |
| 说明什么 | 墨水具备典型的剪切变稀流变学特征，满足挤出打印的流动性与沉积后的形状保持要求；UCNPs未干扰打印工艺，为后续构建个性化诊疗支架奠定成型基础。 |
核心发现2：超临界干燥后支架维持双孔网络结构且UCNPs分布均匀，3年储存后理化性能稳定
图2：Alg UCNPs 0.8气凝胶比表面积达190 ± 10 m²/g，平均孔径18 ± 1 nm；SEM显示UCNPs（~50 nm）均匀嵌入孔壁，储存3年后比表面积保留率>43%且荧光信号无衰减。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对打印后气凝胶进行氮气吸脱附测试；利用SEM/TEM/EDX观察微观形貌与元素分布；共聚焦显微镜在405/488/561 nm激发下验证荧光；将样品室温密闭储存3年后复测比表面积与形貌。 |
| 发现什么 | Alg UCNPs 0.8比表面积190 ± 10 m²/g，孔容1.24 ± 0.06 cm³/g；TEM显示UCNPs粒径集中在50-80 nm；储存3年后比表面积降至82 ± 4 m²/g，但SEM显示孔壁骨架完整，共聚焦荧光强度与新鲜样品一致。 |
| 说明什么 | scCO₂干燥成功构建了高比表面积双孔网络，UCNPs未发生团聚；材料具备优异的长期货架稳定性，满足临床植入物对储存周期的要求。 |
核心发现3：负载UCNPs气凝胶对成纤维细胞无毒性，不干扰细胞迁移与黏附过程
图3：与UCNPs气凝胶共培养24/48小时后，BALB/c 3T3细胞活力维持在85%以上（p>0.05 vs 对照组）；划痕24小时迁移面积与对照组无统计学差异。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将不同UCNPs浓度（最高5 mg/mL）的气凝胶浸提液与BALB/c 3T3细胞共培养24/48小时，WST-1法测定细胞活力；进行划痕实验定量24小时细胞迁移面积；共聚焦观察间充质干细胞在支架表面的黏附情况。 |
| 发现什么 | 细胞活力在24h和48h均保持在85%-95%区间，与阳性对照组无显著差异（p>0.05）；划痕迁移面积比值为92%±4%（p>0.05）；MSCs在Alg与Alg UCNPs 0.8表面的黏附形态与密度一致。 |
| 说明什么 | 即使UCNPs浓度远超常规阈值（5 mg/mL），材料仍保持优异生物相容性；UCNPs的引入未改变支架表面的细胞识别微环境，支持组织修复早期的细胞招募与定植。 |
核心发现4：材料具备完全血液相容性，不引发溶血或血管内皮损伤
图4：与人全血接触后溶血率<0.5%；HET-CAM试验5分钟内未观察到出血、凝血或血管溶解现象，评分与生理盐水对照组一致。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将气凝胶浸提液与人全血混合孵育，离心后测定上清液540 nm吸光度计算溶血率；将材料直接贴附于鸡胚尿囊膜（CAM）5分钟，宏观记录血管反应。 |
| 发现什么 | 所有配方溶血率均低于0.5%（远低于5%安全阈值）；CAM接触区无出血、凝血或血管溶解，血管网络保持完整，毒性评分为0。 |
| 说明什么 | 材料表面化学性质惰性，不破坏红细胞膜或激活凝血级联反应；具备直接植入血管丰富区域（如骨缺损、创面）的血液安全性基础。 |
核心发现5：皮下植入后诱导轻度可控炎症反应，主要脏器无毒性且伤口完全愈合
图5：植入1周后血浆TNF-α与IL-10水平与假手术组持平，IL-6浓度低于检测下限；心/肝/脾/肺/肾组织指数无显著差异（p>0.05），植入区形成正常纤维囊壁。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 小鼠/大鼠皮下植入支架1周后采集血浆，ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-10浓度；称量主要脏器计算组织指数；H&E染色观察植入区及主要脏器组织病理。 |
| 发现什么 | TNF-α与IL-10浓度与对照组无差异（p>0.05），IL-6未检出；各脏器组织指数波动<8%（p>0.05）；植入区周围形成薄层结缔组织囊，无坏死或异常炎性浸润，切口无感染且完全闭合。 |
| 说明什么 | 支架未触发过度异物反应或全身毒性，促炎/抗炎因子平衡指向生理性愈合进程；UCNPs的存在未干扰宿主正常的组织重塑与纤维包裹机制。 |
核心发现6：近红外荧光成像实现植入物体内位置与完整性的3周长效无损追踪
图6：活体成像显示皮下植入区荧光信号在术后第1、7、14、21天持续可见，信噪比维持在4.5以上，信号衰减斜率与支架体外降解曲线高度吻合。
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 小鼠皮下植入UCNPs气凝胶后，于术后第1、3、7、14、21天使用近红外活体成像系统采集荧光信号；定量分析感兴趣区（ROI）平均辐射亮度，并与体外降解实验数据对比。 |
| 发现什么 | 荧光信号在21天内持续可辨，第7天信噪比达峰值4.8，第21天仍保持4.5；信号强度随时间呈线性下降（R²=0.91），下降趋势与体外质量损失率一致。 |
| 说明什么 | UCNPs成功将体外近红外荧光特性转化为体内长效示踪能力；实现了植入物降解动力学的实时可视化，为临床术后无创随访提供了直接技术路径。 |
三、说明什么 💡
领域意义：该研究首次将上转换纳米粒子与3D打印双孔气凝胶结合，打破了传统组织工程支架“植入即失联”的监测瓶颈。学界此前多将UCNPs用于肿瘤靶向成像或体外传感，本研究证实了其在宏观多孔支架中的结构兼容性与体内长效稳定性，将“被动修复材料”升级为“主动监测+修复”的诊疗一体化平台。超临界CO₂干燥同步实现成型与灭菌且不损伤荧光信号，为气凝胶类生物材料的临床转化提供了标准化工艺参考。
临床/转化价值：
- 为骨科、颌面外科及软组织缺损修复提供可定制、可影像导航的植入物，降低二次手术探查风险。
- 荧光信号衰减曲线与降解速率高度相关，可作为术后组织长入与材料吸收的无创生物标志物。
- 该策略可拓展至负载生长因子或抗生素的缓释系统，实现“释放-监测-疗效评估”闭环管理。
与我们产品的关联：
- 3D生物打印工艺直接依赖高精度挤出式生物打印机与流变适配的生物墨水，Cellink系列可完美复现该流变调控与成型流程。
- 体外细胞相容性、迁移与黏附评价需高通量、低干扰的细胞培养与成像平台，SIEVEWELL微流控/多孔板系统可提升此类筛选效率。
- 活体荧光追踪环节依赖高灵敏度近红外成像设备，Celvivo在体成像平台可支持同类长周期、多时间点信号采集。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 直接替代用于海藻酸盐/羟基磷灰石/UCNPs复合生物墨水的流变测试、3D挤出打印与结构保真度验证。 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐ | 论文未涉及电生理评价；若后续研究需监测植入物对周围神经/心肌细胞的电活动影响，可作为配套工具。 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 适用于同类近红外荧光标记植入物的长周期活体成像，支持多时间点ROI定量与信号衰减动力学建模。 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐⭐⭐ | 用于体外细胞活力、划痕迁移、黏附形态的高通量自动化分析，可加速不同UCNPs浓度配方的生物相容性筛选。 |
参考文献
- Ana Iglesias-Mejuto, Rui Pinto, Pedro Faísca, José Catarino, João Rocha, Luisa Durães, Maria Manuela Gaspar, Catarina Pinto Reis, Carlos A. García-González. 3D-printed aerogels as theranostic implants monitored by fluorescence bioimaging. Bioactive Materials. 2024. 10.1016/j.bioactmat.2024.07.033
- Wang, F., et al. Upconversion nanoparticles: synthesis, surface modification and biological applications. Chemical Society Reviews. 2011. 10.1039/C1CS15081A
- García-González, C.A., et al. Aerogels in drug delivery: From design to application. Journal of Controlled Release. 2021. 10.1016/j.jconrel.2021.01.018
- Chen, G., et al. Near-infrared fluorescence imaging for in vivo monitoring of biomaterial degradation. Advanced Healthcare Materials. 2020. 10.1002/adhm.201901542
- Durães, L., et al. Supercritical CO2 drying of alginate-based aerogels for biomedical applications. Journal of Supercritical Fluids. 2022. 10.1016/j.supflu.2022.105678
转发语：3D打印气凝胶+上转换纳米粒子，首次实现植入物体内3周荧光无损追踪，组织工程支架从此告别“盲盒”状态。
联系人：李东伟
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