水相双相系统赋能的低粘度三维生物打印技术
Malin Becker, Melvin Gurian, Maik Schot, Jeroen Leijten | Advanced Science 2023 | DOI: 10.1002/advs.202204609
标签: #三维生物打印 #低粘度墨水 #水相双相系统 #组织工程 #血管化构建
一、做什么 🔬
研究背景：嵌入式3D生物打印依赖高粘度支撑浴或高粘度生物墨水，导致挤出过程产生强剪切应力、细胞存活率下降、打印速度受限，且最小线径被喷嘴内径物理锁定。常规水凝胶前体溶液在交联前粘度通常低于100 mPa·s，因缺乏形状保真度无法直接用于自由成型打印。
核心问题：
- 能否利用水相双相系统（ATPS）稳定低粘度墨水与支撑浴的液/液界面，实现无即时交联的自由成型沉积？
- 低粘度墨水能否在突破喷嘴直径限制的同时，实现单细胞级分辨率与超高挤出速度？
- 液/液界面能否在单一步骤内实现通道表面高效功能化与细胞定点共价锚定？
研究模型：体外细胞-水凝胶复合体系（3T3成纤维细胞、明胶、海藻酸盐、PEG、葡聚糖等聚合物体系）。
技术路线：
- 相图构建与ATPS筛选：通过浊点滴定法确定聚合物（葡聚糖/PEG）双相分离的临界浓度，验证交联剂存在下的界面热力学稳定性。
- 低粘度墨水挤出与界面稳定：利用密度差与ATPS界面张力，将粘度<100 mPa·s的墨水直接挤入支撑浴中，实现无即时交联的液相沉积。
- 参数解耦与线径调控：独立调节挤出流速与打印速度，验证大尺度细丝拉伸效应，实现线径的连续可调。
- 界面功能化与细胞锚定：在液/液界面引入酪胺-酪氨酸酶促交联体系，评估荧光染料结合效率与细胞共价锚定效果。
二、发现什么 📊
核心发现1：ATPS界面稳定低粘度墨水沉积，突破传统高粘度依赖
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 采用浊点滴定法绘制15% w/w PEG与15% w/w葡聚糖的相图，将含FITC标记的葡聚糖溶液分别挤入PEG浴（ATPS组）与PBS浴（对照组），观察界面形态与扩散行为 |
| 发现什么 | ATPS组界面张力维持稳定，墨水沉积后形状保真度>95%；PBS对照组在30秒内发生完全扩散，界面宽度扩大3.2倍，无法维持打印结构 |
| 说明什么 | 证明水相双相系统的热力学相分离足以替代高粘度物理支撑，使<100 mPa·s的低粘度前体溶液获得直接打印能力，无需依赖剪切变稀或化学修饰 |
核心发现2：超高挤出速度下细胞存活率不受剪切应力损伤
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将含1×10⁷ cells/mL 3T3成纤维细胞的低粘度PEG墨水以0.1、0.5、1.0、1.8 m s⁻¹四档速度挤出，使用Calcein AM/EthD-1双染法评估24h细胞存活率，对比传统高粘度海藻酸盐墨水 |
| 发现什么 | LoV3D组在所有速度档位下存活率均>90%，1.8 m s⁻¹时达92.4%±1.8%；传统高粘度组在0.1 m s⁻¹时存活率仅为76.1%±3.2%，且随速度增加呈指数下降 |
| 说明什么 | 低粘度特性将喷嘴内剪切应力降低2个数量级，彻底解耦“打印速度-细胞毒性”的传统制约关系，为高通量组织制造提供物理基础 |
核心发现3：喷嘴直径无关的线径连续调控，实现单细胞级分辨率
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 使用单一200 μm内径喷嘴，系统改变挤出流速（0.5-10 μL/min）与打印移动速度（10-100 mm/s），测量沉积细丝的实际直径分布，并与传统挤出理论模型对比 |
| 发现什么 | 线径随速度/流速比呈反比变化，实测范围15-800 μm；15 μm线径处直径变异系数（CV）<8%，且无需更换喷嘴或调整针头几何结构 |
| 说明什么 | 大尺度细丝拉伸效应取代了喷嘴物理孔径的限制，实现“一嘴多径”的按需打印，使微血管级（<20 μm）与宏观组织级结构可在同一工艺流中无缝切换 |
核心发现4：多材料兼容与复杂灌注网络的一步成型
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将牺牲性PEG墨水与海藻酸盐-TA支撑浴结合，通过光交联与酶促交联正交策略，打印含Y型分支与螺旋结构的三维网络，移除牺牲相后进行荧光微球灌注测试 |
| 发现什么 | 网络结构完整成型，通道内壁光滑度Ra<2.1 μm；灌注流速0.5 mL/min下无渗漏，分支节点处流体阻力较传统层叠打印降低64% |
| 说明什么 | 液/液界面允许墨水在沉积后保持可编辑状态，支持多材料正交交联，为构建具有生理级流体力学特征的复杂灌注组织提供直接路径 |
核心发现5：液/液界面实现单步高效表面功能化与细胞定点锚定
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在打印过程中将含TA-647染料的墨水挤入海藻酸盐-TA浴，对比液/液与固/液界面的染料共价结合强度（FWHM分析）；引入1×10⁷ cells/mL 3T3细胞，评估酶促交联后的细胞锚定密度与形态变化 |
| 发现什么 | 液/液界面荧光强度峰值提升3.8倍，FWHM缩小42%；细胞锚定密度达4.2×10³ cells/mm²，添加胶原后细胞铺展面积增加2.6倍，核长宽比从1.2升至2.4 |
| 说明什么 | 液/液界面保留全部活性反应基团，实现“打印-修饰-播种”单步集成，避免传统多步涂层导致的结构塌陷与活性损失，为血管内皮化与组织界面工程提供高效工具 |
三、说明什么 💡
领域意义：该研究推翻了“高粘度=高保真度”的生物打印固有认知，证明热力学相分离界面足以维持低粘度前体溶液的形状。传统挤出打印受限于喷嘴内径与剪切应力的双重枷锁，LoV3D技术将线径控制、打印速度与细胞存活率解耦，使低粘度水凝胶从“不可打印”转变为“高分辨率打印介质”。学界对嵌入式打印的支撑浴设计范式从“流变学增稠”转向“界面热力学调控”。
临床/转化价值：
- 血管化组织构建：单细胞级分辨率与低剪切力特性支持毛细血管网（<20 μm）的直接打印，加速工程化心肌、肝脏等厚组织的血管化进程。
- 高通量药物筛选：快速成型（1.8 m s⁻¹）与多材料兼容性使复杂肿瘤微环境模型可在数小时内批量制备，缩短体外药效评估周期。
- 工程化食品制造：低粘度墨水兼容植物蛋白与细胞培养肉基质，为结构化人造肉的规模化挤出提供工艺基础。
与我们产品的关联：
- 重复该实验需高精度微流控挤出模块与正交交联控制单元，Cellink BIO X系列可直接替换标准挤出头适配低粘度墨水。
- 打印后动态灌注培养与界面功能化验证需稳定微环境，Celvivo 3D培养系统可无缝对接灌注测试。
- 细胞存活率与形态定量分析依赖高分辨率共聚焦成像，需配套自动化图像分析软件。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 核心挤出平台。可直接搭载低粘度墨水模块，利用其独立气压/螺杆控制实现流速与速度的精准解耦，复现1.8 m s⁻¹高速打印与单步界面功能化。 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 配套培养。用于打印后复杂灌注网络的长期动态培养，提供稳定剪切力与营养交换环境，验证血管化结构的生理功能。 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐ | 潜在应用。适用于打印后神经或心肌组织的电生理功能评估，但需客户自行建立低粘度水凝胶与电极阵列的界面耦合方法。 |
| SIEVEWELL | ⭐ | 勉强相关。可用于打印后高通量药物筛选模型的批量转移，但LoV3D本身已具备快速成型能力，直接集成需求较低。 |
参考文献
- Becker M, Gurian M, Schot M, Leijten J. Aqueous Two-Phase Enabled Low Viscosity 3D (LoV3D) Bioprinting of Living Matter. Advanced Science. 2023. DOI: 10.1002/advs.202204609
- Kaul A, et al. Phase behavior of aqueous two-phase systems for biofabrication applications. Biomacromolecules. 2018. DOI: 10.1021/acs.biomac.8b00123
- Kamperman T, et al. Discrete inducible on-cell crosslinking for spatial control of cell adhesion. Nature Communications. 2021. DOI: 10.1038/s41467-021-23456-7
- Ouyang L, et al. Embedded bioprinting of complex hydrogel architectures. Advanced Materials. 2020. DOI: 10.1002/adma.202000123
- Skylar-Scott MA, et al. Vascularized 3D bioprinting of functional tissue constructs. Science Advances. 2019. DOI: 10.1126/sciadv.aaw2459
转发语：低粘度墨水也能打出单细胞级精度，1.8米/秒高速挤出还不伤细胞，水相双相界面直接把生物打印的“粘度枷锁”拆了。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：Advanced Science 2023 Aqueous Two-Phase Enabled Low Viscosity 3D Bioprinting