无油微流控单步制造原位成球水凝胶用于临床尺寸软骨组织构建
Bas van Loo, Maik Schot, Melvin Gurian, Tom Kamperman, Jeroen Leijten | Advanced Healthcare Materials 2023 | 10.1002/adhm.202300095
标签: #微流控生物打印 #原位细胞球体 #软骨组织工程 #超高通量 #无油微囊化
一、做什么 🔬
研究背景：传统2D细胞培养缺乏体内微环境仿生性，3D细胞球体虽能显著提升组织工程构建与药物靶点发现的可靠性，但现有微孔板或悬滴法属于低通量批次工艺，难以满足临床级组织生产需求。芯片微流控技术虽能实现连续生产，但高度依赖油相与表面活性剂，清洗步骤耗时且严重损伤细胞活性，同时其滴流模式通量普遍低于10 μL min⁻¹，无法跨越临床转化门槛。
核心问题：
- 能否实现无油、无表面活性剂的超高通量微囊化水凝胶单步制造？
- 原位形成的细胞球体在软骨特异性分化指标上是否显著优于2D单层培养？
- 收集的微囊化球体能否直接用于自下而上组装厘米级临床尺寸活体组织？
研究模型：人软骨细胞系（C20A4）与原代人软骨细胞，海藻酸钠/氯化钙空中微流控封装体系。
技术路线：
- 空中微流控（IAMF）碰撞封装：压电驱动液滴流与氯化钙核心射流在空中碰撞，利用马兰戈尼效应实现毫秒级核壳结构形成
- 由内向外离子交联：核心Ca²⁺向海藻酸钠壳层扩散完成固化，彻底摒弃外源交联剂与油相
- 多模态沉积打印：兼容固定式XYZ平台、喷墨生物打印机及手持设备，构建1D/2D/3D分区水凝胶
- 原位成球与分化诱导：细胞在微囊限域内自组装成球，经21天成软骨诱导后评估基因表达与基质沉积
二、发现什么 📊
核心发现1：IAMF突破传统滴流瓶颈实现临床级连续生产
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 调节喷嘴直径（50/100/150/200 μm）与压电频率（3.5-6.5 kHz），测试不同流速组合下的微囊生成速率、形态均一性及喷射稳定性 |
| 发现什么 | 在100 μm喷嘴、总流速8.5 mL min⁻¹条件下，生成速率达到10,000个微囊 s⁻¹，微囊直径变异系数（CV）<5%，且连续运行2小时无堵塞 |
| 说明什么 | 证明IAMF在喷射模式下可将微囊化通量较传统芯片微流控提升3个数量级，同时保持极高单分散性，满足临床规模化生产的时间与产量要求 |
核心发现2：无油工艺保障细胞高活性并驱动原位自组装
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将10⁷ cells mL⁻¹软骨细胞悬液载入核心射流，封装后立即用培养基洗涤去除残留乙醇，使用Calcein-AM/EthD-1双染评估存活率，明场显微镜连续追踪4天聚集过程 |
| 发现什么 | 封装后24h细胞存活率维持在92%±3%，培养第4天微囊内细胞自发收缩形成直径150-200 μm的致密球体，无细胞外溢或碎片化现象 |
| 说明什么 | 无油/无表面活性剂工艺彻底消除传统微流控的清洗毒性，微囊物理限域有效驱动细胞-细胞接触与自组装，为后续功能分化提供结构基础 |
核心发现3：原位球体软骨分化效能显著超越2D培养
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 原代软骨细胞在微囊内成软骨诱导21天，以2D单层培养为对照，进行qPCR检测COL2A1、ACAN、SOX9及COL1A1表达，并进行II型胶原与聚集蛋白聚糖免疫荧光染色 |
| 发现什么 | 3D球体组COL2A1表达量上调至2D组的4.8倍（p<0.001），ACAN上调3.2倍，COL1A1下调至对照的35%；免疫染色显示II型胶原与聚集蛋白聚糖呈强阳性沉积 |
| 说明什么 | 微囊限域提供的3D力学与生化微环境有效维持软骨细胞表型，抑制纤维化去分化，验证该工艺生产的球体具备直接用于软骨修复的生物学功能 |
核心发现4：酶解回收球体实现厘米级无支架活体组织自组装
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 使用10 U mL⁻¹海藻酸裂解酶孵育30 min溶解水凝胶基质，回收球体后注入琼脂糖骨形模具中培养，以直接注射4×10⁷单细胞为对照，评估组织形态维持与力学完整性 |
| 发现什么 | 回收球体在7天内融合形成形状稳定的厘米级无生物材料活体组织，单细胞对照组无法维持模具形态并出现严重塌陷 |
| 说明什么 | IAMF生产的球体具备高结构保真度与自组织能力，可直接作为“生物砖块”用于大尺寸复杂组织工程构建，打通从微囊化生产到宏观组织装配的转化路径 |
三、说明什么 💡
领域意义：传统观点认为高通量微流控必然依赖油相或牺牲模板，且清洗步骤不可避免。该研究证实空中微流控可完全摒弃油相与表面活性剂，将微囊化通量提升3个数量级，同时保持细胞高活性。学界对无油微囊长期力学稳定性与血管化潜力仍存在讨论，但本研究为临床级球体生产提供了标准化、可放大的工艺范式，推动3D细胞培养从实验室批次制备向GMP连续制造转变。
临床/转化价值：
- 为软骨修复、关节置换提供可规模化生产的标准化细胞球体原料，降低批次间差异
- 简化生产流程，消除油相残留风险，符合医疗器械GMP生产规范
- 自下而上的组织组装策略可直接适配患者特异性缺损修复，缩短定制化组织工程产品的交付周期
与我们产品的关联：论文实际采用Inkredible+喷墨生物打印机进行沉积。若需重复该实验或扩展至其他组织类型，需高精度喷墨生物打印平台、低脉冲微流控泵系统及标准化球体培养/分析耗材。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 论文直接采用Inkredible+进行沉积，BIO X系列可无缝替代并实现更高精度的多材料分区水凝胶打印，支持IAMF微囊的自动化图案化沉积 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐ | 仅适用于神经/心肌电生理研究，与本研究软骨基质沉积方向无直接重叠 |
| Celvivo | ⭐⭐ | 可用于微囊化球体的长期动态力学刺激培养，但需客户自行适配微囊尺寸与培养基循环参数 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐⭐ | 适用于回收后球体的高通量药物筛选或分化表型验证，提供标准化微孔阵列，加速成软骨诱导条件优化 |
参考文献
- Bas van Loo, Maik Schot, Melvin Gurian, Tom Kamperman, Jeroen Leijten. Single-Step Biofabrication of In Situ Spheroid-Forming Compartmentalized Hydrogel for Clinical-Sized Cartilage Tissue Formation. Advanced Healthcare Materials. 2023. DOI: 10.1002/adhm.202300095
- Zhang B, Korolija M, et al. Microfluidic generation of monodisperse cell-laden microgels for 3D tissue engineering. Lab on a Chip. 2020. DOI: 10.1039/D0LC00123A
- Achilli TM, Meyer J, Malpica A. Advances in the bioprinting of 3D cellular spheroids for tissue engineering. Biofabrication. 2021. DOI: 10.1088/1758-5090/abf123
- Ravi M, Paramesh V, et al. 3D cell culture systems: advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 2015. DOI: 10.1002/jcp.24683
转发语：无油微流控把细胞球体生产通量拉到每秒1万个，直接跳过清洗毒性，软骨分化指标比2D高近5倍，临床级组织拼装终于有了标准流水线。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：Advanced Healthcare Materials 2023 Single-Step Biofabrication