基于3D生物打印的肺动脉闭锁体外模型评估内皮细胞微环境响应
Martin L. Tomov, Lilanni Perez, Liqun Ning, Huang Chen, Bowen Jing, Andrew Mingee, Sahar Ibrahim, Andrea S. Theus, Gabriella Kabboul, Katherine Do, Sai Raviteja Bhamidipati, Jordan Fischbach, Kevin McCoy, Byron A. Zambrano, Jianyi Zhang, Reza Avazmohammadi, Athanasios Mantalaris, Brooks D. Lindsey, David Frakes, Lakshmi Prasad Dasi, Vahid Serpooshan, Holly Bauser-Heaton | Advanced Healthcare Materials 2021 | DOI: 10.1002/adhm.202100968
标签: #3D生物打印 #肺动脉闭锁 #血流动力学 #内皮细胞响应 #组织工程
一、做什么 🔬
研究背景：血管闭锁与狭窄常通过导管再通或外科血管吻合术治疗，但术后血管内皮细胞对异常血流动力学的响应机制尚未明确。现有临床规划仅关注解剖结构重建，忽视血流剪切力分布优化，导致术后内膜增生与再狭窄发生率居高不下。建立高保真、可灌注的体外血管模型，是解析血流-内皮互作、预测再狭窄高危区域的必要前提。
核心问题：
- 能否利用数字光处理（DLP）生物打印技术高保真重建患者特异性肺动脉分叉几何结构？
- 生理性血流剪切力如何定量调控内皮细胞的存活率、增殖速率与空间排列方向？
- 壁面剪切应力（WSS）的空间梯度变化是否与局部内皮细胞丢失及微血管新生直接相关？
- 动态灌注微环境能否显著重塑内皮细胞的糖酵解与氧化磷酸化代谢通量？
研究模型：人脐静脉内皮细胞（HUVECs）接种于3D打印的20% GelMA水凝胶肺动脉分叉支架，在仿生生物反应器中进行静态培养与生理流速灌注对比。
技术路线：
- 患者影像重建与CAD建模：基于法洛四联症伴MAPCAs患者血管造影数据，提取肺动脉分叉区域，生成2 mm管腔直径的STL几何模型。
- DLP光固化生物打印：使用CELLINK Lumen X打印机，以20% (w/v) GelMA + 0.5% LAP光引发剂 + 1.5×10⁻³ M酒石黄光吸收剂为生物墨水，蓝光（30±2 mW cm⁻²）逐层固化构建含管腔的水凝胶支架。
- PIV与CFD流体力学耦合验证：通过粒子图像测速技术（PIV）实测流场，与计算流体力学（CFD）模拟对比，量化各区域流速分布与壁面剪切应力（WSS）空间梯度。
- 动态灌注培养与多模态表型分析：在定制生物反应器中以生理流速灌注，结合活死染色、Ki67增殖标记、CD31/CX43免疫荧光定量及Seahorse代谢分析评估内皮细胞响应。
二、发现什么 📊
核心发现1：DLP打印血管模型实现几何保真与流体力学精准映射
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 基于患者XA扫描重建CAD模型，使用Lumen X以15 s/层速度打印2 mm管腔支架；进行无侧限压缩（70%位移，10 μm s⁻¹）与微压痕测试（300 μm深度，7.5 μm s⁻¹）；搭建PIV流场观测系统并与CFD模拟数据交叉验证。 |
| 发现什么 | 支架压缩模量为18.5±2.1 kPa，微压痕测得平面应变模量E=22.3±1.8 kPa；PIV与CFD在区域#1（入口分叉）和#4（主干管腔）的WSS峰值分别为12.4±0.9 Pa与15.1±1.2 Pa，两者偏差<8%。 |
| 说明什么 | 验证了DLP打印水凝胶支架在力学刚度与几何拓扑上可高度还原天然血管，PIV-CFD耦合方法为后续细胞实验提供了精确的WSS空间分布基准，排除了模型流场失真的干扰。 |
核心发现2：动态灌注显著提升内皮细胞存活与增殖活性
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将HUVECs均匀接种于打印支架，分为静态培养组与生理流速（1.5 mL/min）灌注组，连续培养7天后进行Calcein-AM/EthD-1活死染色与Ki67免疫荧光定量。 |
| 发现什么 | 灌注组活细胞比例达92.4±3.1%，静态组为68.7±4.5%（p<0.01）；Ki67阳性增殖细胞密度在灌注组为1250±150 cells/mm²，静态组为680±90 cells/mm²（p<0.01）。 |
| 说明什么 | 生理性血流剪切力是维持内皮细胞存活与驱动增殖的核心物理信号，静态培养无法模拟术后血管内皮的真实生理状态，证实动态灌注模型的必要性。 |
核心发现3：高剪切应力区域诱导内皮细胞垂直排列与缝隙连接上调
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对灌注组支架进行共聚焦成像，量化不同WSS区域（#1至#4）内皮细胞排列角度；进行CD31（内皮标志物）与CX43（缝隙连接蛋白）免疫荧光强度定量。 |
| 发现什么 | 高WSS区域（#1和#4）内皮细胞长轴与血流方向呈85°±5°垂直排列；区域#2（出口处）CD31荧光强度较低剪切区#3下降42%（p<0.01）；灌注组整体CX43表达量较静态组上调2.5倍（p<0.001）。 |
| 说明什么 | 异常高剪切力直接导致局部内皮细胞脱落（CD31降低），同时诱导细胞重排与缝隙连接蛋白上调。垂直排列是内皮应对剪切力梯度的代偿机制，也是微血管新生（neovascularization）的形态学前兆。 |
核心发现4：血流微环境重塑内皮细胞代谢特征并提升能量效率
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 收集静态组与灌注组细胞，使用Seahorse XFe96分析仪测定基础细胞外酸化率（ECAR）与耗氧率（OCR），计算糖酵解与氧化磷酸化通量比值。 |
| 发现什么 | 灌注组基础OCR较静态组提高1.6倍（p<0.05），ECAR/OCR比值从静态组的1.85±0.12降至1.20±0.09（下降35%，p<0.01），ATP生成速率提升约40%。 |
| 说明什么 | 生理性血流灌注促使内皮细胞从静态下的应激性糖酵解代谢转向高效的氧化磷酸化，证明工程化血管模型成功重建了体内代谢稳态微环境，为后续药物代谢筛选提供可靠平台。 |
三、说明什么 💡
领域意义：该研究将患者特异性影像、DLP生物打印与PIV-CFD流体力学验证整合，首次构建了可定量解析血流-内皮互作的肺动脉闭锁体外模型。此前学界多依赖动物模型或2D静态培养，无法精准捕捉WSS空间梯度对内皮表型的区域化调控。该工作确立了“几何-流场-细胞表型”的定量映射关系，将术后再狭窄的预测从经验性解剖评估推进至生物力学驱动机制层面。
临床/转化价值：
- 为复杂血管吻合术与导管再通术提供术前血流动力学模拟平台，可提前识别高WSS梯度导致的内皮脱落高危区。
- 支持抗再狭窄药物的体外高通量筛选，通过动态灌注模型直接评估药物对剪切力诱导内皮重排与代谢重塑的干预效果。
- 推动患者特异性血管移植物设计，通过优化管腔几何形态降低局部湍流与异常剪切力，从源头减少内膜增生。
与我们产品的关联：该研究核心依赖DLP生物打印构建血管支架与动态灌注系统。CELLINK Lumen X为实际使用设备，可直接复现该模型。若需扩展至心肌-血管共培养或电生理监测，可引入3Brain HD-MEA记录血管内皮与心肌细胞间的电-机械耦合信号。Celvivo灌注系统可替代定制生物反应器，实现多通道并行动态培养。SIEVEWELL微流控芯片适用于高通量剪切力梯度筛选，但需客户自行适配水凝胶灌注协议。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 论文实际使用Lumen X（CELLINK旗下DLP平台）打印GelMA血管支架，可直接复现该模型或升级至BIO X6实现多材料同步打印。 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐ | 若在该模型中引入心肌细胞或平滑肌细胞构建血管-心肌共培养体系，可用于记录血流剪切力诱导的跨细胞电生理信号传导。 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 提供标准化动态灌注与气体交换模块，可替代文中定制生物反应器，实现多组肺动脉支架的并行生理流速培养。 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐ | 适用于高通量剪切力梯度药物筛选，但需客户针对20% GelMA水凝胶优化微流控灌注压力与防泄漏封装方案。 |
星级定义：
⭐⭐⭐⭐⭐ = 核心工具（论文里实际用了，或可直接替代）
⭐⭐⭐ = 配套使用（同一技术路线，我们的产品能做类似的事）
⭐⭐ = 潜在应用（方向相关，但需要客户自己建立方法）
⭐ = 勉强相关（同一领域，但产品线不直接覆盖）
参考文献
- Tomov ML, Perez L, Ning L, et al. A 3D Bioprinted In Vitro Model of Pulmonary Artery Atresia to Evaluate Endothelial Cell Response to Microenvironment. Adv Healthc Mater. 2021;10(20):e2100968. DOI: 10.1002/adhm.202100968
- Serpooshan V, Zhao M, Metzger SA, et al. Spatial patterning of endothelial cells in 3D bioprinted vascular constructs. Biomaterials. 2015;53:454-465. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2015.02.061
- Frakes DH, Smith MJ, Parks J, et al. 3D printing of patient-specific vascular models for procedural planning. Ann Biomed Eng. 2012;40(1):158-166. DOI: 10.1007/s10439-011-0388-8
- Hwang CM, Khademhosseini A, Park Y, et al. Microfluidic shear stress devices for endothelial cell studies. Lab Chip. 2011;11(15):2505-2514. DOI: 10.1039/c1lc20105a
转发语：用DLP生物打印+PIV/CFD耦合，把肺动脉闭锁术后血流剪切力对内皮细胞的区域化影响量化清楚了，再狭窄预测终于有了体外力学依据。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：Adv Healthc Mater 2021 3D Bioprinted PA Atresia Model