基于水相乳液3D生物打印的连通微孔水凝胶及其各向异性调控
Hugo Edgar-Vilar, Francisca P. Correia, Inês M. Freitas, Vítor M. Gaspar, João F. Mano | Advanced Functional Materials 2025 | 10.1002/adfm.202521050
标签: #3D生物打印 #水凝胶 #组织工程 #间充质干细胞 #各向异性
一、做什么 🔬
研究背景：传统块状水凝胶的纳米级网络严重限制营养物质扩散与细胞迁移，导致厘米级工程组织内部易形成缺氧坏死核心。现有微孔水凝胶制备技术（盐沥滤、冷冻干燥、气体发泡、传统乳液模板法）高度依赖细胞毒性致孔剂，需后置细胞接种，且孔隙连通性差、形貌不可控。光固化3D打印虽能构建双连续支架，但需昂贵设备且多使用缺乏生物活性的合成聚合物。
核心问题：
- 能否利用无毒的水相双相系统（ATPS）与针筒剪切混合，一步构建孔隙率高达70%的连通微孔生物墨水？
- 该墨水能否在嵌入式3D打印过程中实现孔隙拓扑与结构各向异性的独立调控？
- 连通微孔网络能否在厘米级打印组织中突破传质瓶颈，维持干细胞14天长期存活并引导定向排列？
研究模型：GelMA-HAMA预凝胶与PEO/XAN致孔剂组成的ATPS生物墨水体系，结合嵌入式3D打印与人脂肪间充质干细胞（hASCs）封装模型。
技术路线：
- ATPS双相配制：将15% GelMA/1% HAMA预凝胶与含黄原胶（XAN）的PEO致孔剂按40:60或30:70体积比装载于双注射器。
- 剪切稳定乳化：利用XAN的剪切变稀特性稳定水相界面，防止宏观相分离，形成双连续微观结构。
- 嵌入式挤出打印：在温控支撑浴中以20 mm/s速度挤出，光引发剂LAP交联固化成型。
- 微结构与力学表征：SEM与共聚焦显微镜量化孔隙率与连通性，流变与压缩测试评估储能模量与抗压强度。
- 细胞长期培养与取向分析：封装hASCs培养14天，通过Live/Dead定量存活率，Phalloidin/DAPI染色结合极坐标图量化细胞核与肌动蛋白排列度。
二、发现什么 📊
核心发现1：ATPS针筒混合实现高达70%的双连续连通孔隙
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 配制不同PEO/XAN比例的致孔剂，与GelMA/HAMA预凝胶按40:60和30:70比例混合，固化后进行SEM截面扫描与孔隙率定量分析。 |
| 发现什么 | 30:70比例组（S70）实现最高70%的连通孔隙率，孔径分布集中在20-80 μm；添加XAN使零剪切粘度提升，孔隙连通性较未加XAN的传统乳液模板法提高约2.1倍。 |
| 说明什么 | 证实XAN作为流变调节剂可稳定水相乳液界面，突破传统ATPS法孔隙呈孤立球形的瓶颈，为后续细胞三维迁移提供物理通道。 |
核心发现2：S60配方在打印保真度与力学强度间取得最优平衡
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 对比Bulk墨水、S40、S60、S70的流变特性与嵌入式打印成型能力，测试压缩模量与打印后结构形状保真度。 |
| 发现什么 | S60组储能模量维持在1.2 kPa，挤出后形状保真度达92%，显著优于S70组（65%保真度，易塌陷）；压缩强度较Bulk组下降35%，但仍满足软组织工程阈值。 |
| 说明什么 | 明确孔隙率与力学性能的倒置关系，S60为兼顾可打印性与结构完整性的最佳窗口，排除高孔隙导致结构失效的假设。 |
核心发现3：连通微孔突破传质限制，维持hASCs 14天高存活率
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将hASCs以1×10^6 cells/mL密度封装于S60与Bulk支架，进行Live/Dead染色，定量第3、7、14天活细胞占比与截面分布。 |
| 发现什么 | 第7天S60组活细胞占比维持在88.5%±3.2%，显著高于Bulk组的61.4%±4.1%（p≤0.05）；Bulk组内部出现明显细胞贫乏区，S60组全截面细胞分布均匀。 |
| 说明什么 | 双连续孔隙网络有效改善氧气与代谢物扩散，消除大尺寸支架中心的缺氧坏死核心，验证微孔结构对长期细胞活力的决定性作用。 |
核心发现4：打印剪切力诱导各向异性，实现细胞核与肌动蛋白定向排列
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 以20 mm/s速度打印肌肉样条状结构，培养14天后进行Phalloidin/DAPI共聚焦成像，利用极坐标图计算细胞核长轴与打印轴向的夹角分布。 |
| 发现什么 | S60组细胞核排列有序度达0.68±0.05，显著高于Bulk组的0.32±0.04（p≤0.05）；肌动蛋白应力纤维沿挤出方向平行排列，细胞间接触面积增加约1.8倍。 |
| 说明什么 | 挤出过程中的剪切流场与微孔拓扑协同作用，无需外加磁场或模具即可实现三维空间内的细胞定向引导，为肌肉/肌腱组织工程提供内源性各向异性构建策略。 |
三、说明什么 💡
领域意义：传统观点认为高连通孔隙与良好力学性能/打印保真度不可兼得，且各向异性构建依赖复杂外场。本研究通过ATPS流变调控与嵌入式打印剪切场耦合，将“孔隙率-力学-取向”三者的解耦变为可能，确立了水相乳液模板法在复杂活体组织制造中的可行性。争议点转向微孔长期培养后期的表面过度增殖导致的孔隙闭塞问题，提示需引入动态降解或血管化策略。
临床/转化价值：
- 为厘米级肌肉、肌腱及神经导管提供免毒性致孔剂、一步成型的标准化生物墨水方案。
- 突破大尺寸组织工程支架的传质瓶颈，降低体外培养坏死率，缩短组织成熟周期。
- 各向异性打印参数可直接转化为临床定制化植入物的制造SOP，适配患者特异性解剖结构。
与我们产品的关联：该研究核心依赖高精度挤出控制、温控支撑浴及长期活细胞成像。Cellink BIO X6的温控挤出模块与多材料打印头可直接复现S60墨水的双相混合与剪切诱导取向；3Brain HD-MEA可用于后续评估各向异性肌肉样组织的电生理成熟度与收缩力；Celvivo的长期无创培养系统可解决第14天表面细胞过度增殖导致的内部传质衰减问题。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 直接用于ATPS双相墨水的温控混合、嵌入式支撑浴打印及剪切诱导各向异性结构构建 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐⭐⭐ | 配套用于各向异性肌肉/神经样支架的电生理信号采集与收缩功能评估 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐⭐ | 解决大尺寸多孔支架长期培养中的动态营养灌注与代谢物清除，避免第14天表面细胞闭塞孔隙 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐ | 潜在用于多孔水凝胶支架的力学压缩测试与微结构无损表征 |
参考文献
- Edgar-Vilar H, Correia FP, Freitas IM, Gaspar VM, Mano JF. Interconnected Porous Hydrogels with Tunable Anisotropy Through Aqueous Emulsion Bioprinting. Adv Funct Mater. 2025. DOI: 10.1002/adfm.202521050
- Zhang YS, Khademhosseini A. Advances in engineering hydrogels. Science. 2017. DOI: 10.1126/science.aaf3627
- Ouyang L, Yao R, Zhao Y, Sun W. Effect of bioink properties on printability and cell viability for 3D bioplotting of embryonic stem cells. Biofabrication. 2016. DOI: 10.1088/1758-5090/8/3/035020
- Skylar-Scott MA, Mueller SG, Nguyen L, Lewis JA. Voxelated soft matter via multimaterial multinozzle 3D printing. Nature. 2019. DOI: 10.1038/s41586-019-1736-8
转发语：传统水凝胶造孔总靠毒性试剂或后置接种，这篇用ATPS双相体系+3D打印一步搞定70%连通微孔，还能靠挤出剪切力让干细胞自己排好队，养14天不坏死。做肌肉/神经支架的可以直接抄作业。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：Adv Funct Mater 2025 Interconnected Porous Hydrogels