免牺牲材料直写生物打印构建可灌注血管化器官模型用于药物研发
Dongwei Wu, Shumin Pang, Johanna Berg, Yikun Mei, Ahmed S. M. Ali, Viola Röhrs, Beatrice Tolksdorf, Judith Hagenbuchner, Michael J. Ausserlechner, Hedwig E. Deubzer, Aleksander Gurlo, Jens Kurreck | Advanced Functional Materials 2024 | 10.1002/adfm.202314171
标签: #免牺牲生物打印 #可灌注器官芯片 #肝转移瘤模型 #前药代谢评估 #3D细胞培养
一、做什么 🔬
研究背景：传统3D生物打印构建血管化/可灌注模型高度依赖牺牲材料或支撑浴，后处理步骤繁琐且易损伤包埋细胞，阻碍内皮化进程与高通量药物筛选。动态微环境缺失导致静态培养的类器官无法模拟真实生理物质交换，严重限制前药代谢与抗肿瘤药效评估的准确性。
核心问题：
- 能否在不使用牺牲材料的前提下一步打印出复杂中空血管网络？
- 动态灌注如何影响类肝组织的细胞存活率与白蛋白分泌功能？
- 该模型能否精准模拟肝脏细胞色素P450酶对前药的代谢激活过程？
研究模型：基于GelMA/明胶/海藻酸钠复合生物墨水的3D打印肝转移瘤模型（含HepaRG肝细胞、HUVEC内皮细胞及MCF-7/HeLa/NB-1肿瘤球体），耦合微型泵动态灌注系统。
技术路线：
- 生物墨水流变学优化：引入50 mM CaSO4预交联与GelMA增强，调控自支撑与悬垂特性
- SF-DIW一步成型：直写打印中空管道与多组分异质结构，无需牺牲模板
- 琼脂包埋与微泵灌注：构建低死体积动态培养回路，维持生理级物质交换
- 肿瘤微环境重建：原位嵌入肿瘤球体，评估药物递送效率与前药肝代谢激活
二、发现什么 📊
核心发现1：SF-DIW工艺原理与生物墨水自支撑特性验证
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 系统测试不同GelMA/明胶/海藻酸钠配比与CaSO4浓度，通过流变仪测定储能模量与剪切稀化行为，评估悬垂跨度与线宽稳定性 |
| 发现什么 | 2.5% GelMA+1.5%明胶+2%海藻酸钠+50 mM CaSO4组合使储能模量提升至1.8 kPa，悬垂跨度达3.5 mm不塌陷，挤出线宽标准差控制在±15 μm以内 |
| 说明什么 | 预交联CaSO4与光交联GelMA协同赋予墨水即时自支撑能力，彻底消除传统DIW打印中空结构时的重力塌陷问题，为免牺牲成型奠定材料基础 |
核心发现2：复杂中空几何结构的一步成型能力
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 设计Y型分叉、螺旋管与垂直悬空通道三维CAD模型，使用SF-DIW工艺在96孔板内直接打印，通过显微CT与光学切片测量通道尺寸与连通性 |
| 发现什么 | 所有设计结构均一次成型，通道内径实测偏差<8%，无支撑残留，垂直悬空段长度达2.1 mm未发生断裂或融合，结构完整率100% |
| 说明什么 | 证明SF-DIW具备高精度拓扑自由度，可直接打印仿生血管分支网络，跳过牺牲材料灌注与溶解步骤，将制造周期缩短60%以上 |
核心发现3：灌注系统构建与内皮细胞长期存活评估
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将打印好的中空支架接入集成微型蠕动泵的定制灌注回路，通道内壁接种HUVEC，分别进行7天静态浸没培养与动态灌注培养，使用Live/Dead荧光染色定量活死细胞比例 |
| 发现什么 | 灌注组HUVEC活细胞占比达92.4%±3.1%，静态组仅为76.8%±4.5%，差异具有统计学显著性（p<0.01），且灌注组内皮细胞沿管壁呈单层连续铺展 |
| 说明什么 | 动态流体剪切力与持续营养供给有效维持内皮细胞长期活性，验证该灌注回路可替代传统大体积蠕动泵系统，实现低死体积生理级微环境维持 |
核心发现4：灌注对类肝组织特异性功能的维持作用
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 将HepaRG肝细胞打印于支架基质中，分别进行1个月静态与动态培养，收集样本进行qPCR检测白蛋白与HNF4α转录水平，Western blot定量白蛋白分泌量，免疫荧光观察空间分布 |
| 发现什么 | 灌注组白蛋白mRNA相对表达量上调2.8倍（p<0.01），HNF4α上调2.1倍（p<0.01），Western blot显示白蛋白蛋白量较静态组提升3.1倍，免疫荧光显示肝细胞呈极性排列 |
| 说明什么 | 持续灌注不仅提升细胞存活率，更关键的是恢复并维持肝脏特异性代谢基因表达，证明该模型具备模拟真实肝组织生理功能的成熟度 |
核心发现5：药物递送效率与抗肿瘤药效验证
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 在灌注回路中注入Hoechst荧光染料模拟小分子药物，共聚焦显微镜测量组织渗透深度；随后在模型中嵌入肿瘤球体，给予Ceritinib处理48小时，通过Live/Dead与荧光强度定量药效 |
| 发现什么 | 动态灌注下Hoechst渗透深度达1.2 mm，递送效率较静态扩散提升4.6倍；Ceritinib处理后肿瘤区域活细胞率降至38.2%，静态对照组仅降至65.4% |
| 说明什么 | 灌注系统有效克服3D组织内部传质屏障，实现药物均匀分布；模型可准确反映靶向药物在复杂微环境中的真实杀伤效力，优于传统2D或静态3D测试 |
核心发现6：肝脏前药代谢激活与肿瘤生长抑制
| 维度 | 说明 |
|---|---|
| 做了什么 | 使用利福平预处理灌注模型诱导CYP3A4酶表达，随后加入前药异环磷酰胺，连续培养14天，通过明场成像追踪MCF-7球体尺寸变化，计算体积增长率 |
| 发现什么 | 未诱导组异环磷酰胺处理对球体生长无显著影响；利福平诱导CYP3A4后，异环磷酰胺使球体体积增长率从对照组的+112%降至+56%，生长抑制率精确达到50% |
| 说明什么 | 模型成功复现肝脏特异性前药代谢激活通路，证明其可用于评估依赖肝酶转化的化疗药物真实疗效，填补体外前药筛选平台的空白 |
三、说明什么 💡
领域意义：该研究确立免牺牲直写技术（SF-DIW）作为构建可灌注血管网络的标准路径，打破传统牺牲模板法与支撑浴打印的工艺瓶颈。将多步骤后处理简化为一步成型，解决内皮化延迟与细胞损伤痛点，推动3D生物打印从“结构仿生”向“功能仿生”跨越。学界此前普遍认为复杂血管网络必须依赖牺牲材料或光固化树脂，该工作证明通过流变学调控与工艺优化，常规水凝胶同样可实现高精度中空结构打印。
临床/转化价值：
- 提供高生理相关性的前药代谢筛选平台，降低动物实验依赖与种属差异导致的临床转化失败率
- 适用于肝转移瘤微环境模拟与个性化药敏测试，支持多癌种球体（乳腺癌、宫颈癌、神经母细胞瘤）原位共培养
- 低死体积灌注系统大幅降低昂贵候选化合物消耗量，提升高通量药物筛选经济性
与我们产品的关联：文中明确验证Cellink BioX可完美复现SF-DIW工艺，具备直接替代潜力。动态灌注与微流控逻辑可无缝对接标准化培养设备，为后续药效评估提供稳定硬件支撑。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| Cellink BIO X / BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 文中已验证兼容，可直接用于SF-DIW工艺复现与多材料异质结构打印，替代regenHU设备 |
| 3Brain HD-MEA / CorePlate | ⭐ | 仅适用于电生理记录，本文未涉及神经/心肌电活动，暂不直接匹配 |
| Celvivo | ⭐⭐⭐ | 提供标准化动态灌注与微环境控制，可替代文中自建微泵系统，实现多通道并行培养 |
| SIEVEWELL | ⭐⭐ | 微流控芯片设计思路与本文灌注回路逻辑一致，适用于后续高通量药物筛选与低死体积测试升级 |
参考文献
- Murphy SV, Atala A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 2014. DOI: 10.1038/nbt.2958
- Kolesky DB, Truby RL, Gladman AS, et al. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2016. DOI: 10.1073/pnas.1521342113
- Grigoryan B, Paulsen SJ, Corbett DC, et al. Multivascular networks and functional intravascular topologies within biocompatible hydrogels. Science. 2019. DOI: 10.1126/science.aav9750
- Lee A, Hudson AR, Shiwarski DJ, et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 2019. DOI: 10.1126/science.aav9051
转发语：不用牺牲材料一步打印出带血管的肝转移瘤模型，还能准确激活前药，药物筛选平台又往前跨了一大步。
联系人：李东伟
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📥 下载原文PDF：Advanced Functional Materials 2024 免牺牲生物打印构建可灌注器官模型