微工程化可灌注 3D 生物打印胶质母细胞瘤模型用于体内模拟肿瘤微环境
Lena Neufeld, Eilam Yeini, Noa Reisman, Yael Shtilerman, Dikla Ben-Shushan, Sabina Pozzi, Asaf Madi, Galia Tiram, Anat Eldar-Boock, Shiran Ferber, Rachel Grossman, Zvi Ram, Ronit Satchi-Fainaro* | Science Advances 2021 | DOI: 10.1126/sciadv.abi9119
标签: #胶质母细胞瘤 #3D生物打印 #血管化 #肿瘤微环境 #药物筛选 #CELlINK #3Brain
| 维度 | 信息 |
|---|---|
| 研究目的 | 构建包含功能性血管网络的 3D 生物打印胶质母细胞瘤（GB）模型，用于更真实地模拟体内肿瘤微环境（TME）和药物反应 |
| 核心技术 | 纤维蛋白/明胶 3D 生物墨水 + Pluronic F127 牺牲墨水直写打印 + 微流控灌注系统 |
| 关键发现 | 3D 模型在细胞侵袭、药物耐受（TMZ）和基因表达谱上均显著优于 2D 培养，更接近体内脑组织状态 |
| 验证体系 | 小鼠 GB 细胞（GL261）、人 GB 细胞系（U-87MG/T98G）、患者原代 GB 细胞、C57BL/6 小鼠体内模型 |
一、做什么 🔬
核心问题：现有的胶质母细胞瘤体外模型（2D 培养、简单 3D 球体）缺乏功能性血管网络和真实的肿瘤微环境，无法准确预测药物在体内的疗效和耐药性。
解决方案：研究团队开发了一种可灌注的 3D 生物打印 GB 模型：
- 肿瘤生物墨水：纤维蛋白原 + 明胶 + 转谷氨酰胺酶交联，内含 GB 细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞
- 血管生物墨水：Pluronic F127（热可逆牺牲材料），打印后 4°C 液化冲洗形成中空管道
- 血管化：管道内壁接种 HUVEC（人脐静脉内皮细胞）和脑周细胞，连接蠕动泵实现持续灌注
| 模型组分 | 材料/细胞 | 功能 |
|---|---|---|
| 肿瘤基质 | 纤维蛋白原 + 明胶（3-12%）+ TG 酶 | 模拟脑组织 ECM，可调刚度 |
| 牺牲模板 | Pluronic F127 + 凝血酶 | 打印后液化形成血管通道 |
| 肿瘤细胞 | GL261 / U-87MG / T98G / 患者原代 | 构建肿瘤核心 |
| 基质细胞 | 星形胶质细胞 + 小胶质细胞 | 模拟脑 TME |
| 血管内皮 | HUVEC（mCherry 标记） | 形成血管内壁 |
| 周细胞 | 人脑微血管周细胞（iRFP 标记） | 稳定血管结构 |
二、发现什么 📊
Figure 1：生物墨水表征——明胶浓度决定物理性能与细胞行为
图1：（A）不同明胶浓度（3%/6%/12%）水凝胶的杨氏模量；（B）平衡溶胀率；（C-F）高浓度明胶中细胞形成大团簇，低浓度中细胞分散生长。
| 做了什么 | 测量了 3%/6%/12% 明胶浓度水凝胶的杨氏模量和溶胀率，并观察 GL261 和患者原代 GB 细胞（PD-GB4）在其中的 28 天生长形态 |
| 发现什么 | 12% 明胶组杨氏模量最高（~4-5 kPa），且 GL261 细胞培养 28 天后刚度显著提升至 ~7 kPa；12% 明胶溶胀率最高（~25%）；高浓度明胶中细胞形成大团簇（类似肿瘤实体），低浓度中细胞分散 |
| 说明什么 | 明胶浓度可独立调控水凝胶的力学性能和细胞空间分布，为后续模拟不同硬度脑区提供了可调平台 |
图1→图2的逻辑：确认了生物墨水的物理性能和细胞兼容性后，需要进一步验证该体系是否支持肿瘤细胞与基质细胞的长期共培养和功能互作——这正是图2要回答的生物学问题。
Figure 2：3D 脑模拟生物墨水的生物相容性与长期细胞活力
图2：（A）免疫荧光显示 GB 细胞（PD-GB4, 青色）与星形胶质细胞（GFAP, 绿色）和小胶质细胞（IBA1, 绿色）在 3D 生物墨水中共培养 7 天后的形态；（B）细胞生长曲线：PD-GB4 + hAstro 共培养组 35 天内增殖显著高于单独 PD-GB4 组（P=0.004）；（C）3D 侵袭定量：共培养组侵袭水平显著更高（P=0.009）；（D）SEM 显示细胞 laden 生物墨水孔径（~7 μm）显著大于无细胞组（~4.5 μm, P=2×10⁻¹³），且肿瘤脑组织孔径大于健康脑组织（P=0.0002）。
| 做了什么 | 将患者原代 GB 细胞（PD-GB4）与人间质细胞（星形胶质细胞 hAstro、小胶质细胞 hMG）共培养于纤维蛋白 3D 生物墨水中，通过免疫荧光、生长曲线、侵袭 assay 和 SEM 评估生物相容性和细胞行为 |
| 发现什么 | 免疫荧光确认三种细胞在 3D 生物墨水中均保持活性并表达各自标志物（GFAP/IBA1）；PD-GB4 + hAstro 共培养组 35 天增殖速率比单独组提高了约 2 倍（P=0.004）；共培养组侵袭水平提高约 3 倍（P=0.009）；SEM 显示细胞 laden 生物墨水孔径显著增大（~7 vs ~4.5 μm），模拟了肿瘤脑组织相对于健康脑组织的结构变化 |
| 说明什么 | 纤维蛋白 3D 生物墨水不仅支持 GB 细胞长期存活，还能重建肿瘤微环境中的关键细胞互作——星形胶质细胞主动促进肿瘤增殖和侵袭，这与体内观察到的现象高度一致 |
图2→图3的逻辑：确认了 3D 生物墨水的生物相容性和细胞互作能力后，下一步需要解决静态 3D 培养的核心瓶颈——缺乏血管网络导致的营养/药物递送受限。这正是图3要构建的可灌注血管化模型。
Figure 3：血管通道打印与灌注验证
图3：（A-D）打印过程示意图：在肿瘤生物墨水中打印 Pluronic F127 分形血管网络，液化后形成中空通道；（E）蓝色染料灌注验证通道连通性；（F-G）灌注生物反应器系统；（H-L）共聚焦 3D 重建显示内皮细胞（红色）成功贴壁形成血管内壁。
| 做了什么 | 使用 3D-Bioplotter 在含 GB 细胞的纤维蛋白生物墨水中打印 Pluronic F127 分形血管网络，4°C 液化冲洗后接种 HUVEC 和周细胞，连接蠕动泵进行持续灌注培养 |
| 发现什么 | 蓝色染料灌注实验证明打印通道完全连通且无泄漏；共聚焦 3D 重建显示 HUVEC 成功在管道内壁形成单层连续覆盖，周细胞稳定附着；灌注条件下细胞存活超过 7 周 |
| 说明什么 | 牺牲墨水打印技术可在含细胞的 3D 水凝胶内部创建功能性血管网络，实现了营养物质和药物的可灌注递送，这是传统静态 3D 培养无法做到的 |
图3→图4的逻辑：有了可灌注的血管化 GB 模型，接下来需要验证这个模型能否捕捉真实的肿瘤生物学行为——特别是星形胶质细胞对肿瘤侵袭的促进作用。
Figure 4：星形胶质细胞促进 GB 细胞 3D 侵袭
图4：（A-B）免疫荧光显示 GB 细胞在含/不含星形胶质细胞的 3D 基质中的侵袭形态；（C）定量分析：PD-GB4 + hAstro 组侵袭显著高于 PD-GB4 单独组（P=0.009）；（D-E）SEM 显示细胞在多孔支架中的粘附和伪足延伸。
| 做了什么 | 将患者原代 GB 细胞（PD-GB4）与人间质细胞（星形胶质细胞 hAstro）共培养于 3D 生物墨水中，通过荧光定量和 SEM 观察肿瘤侵袭行为，并使用 P-选择素抑制剂（KF38789）处理 |
| 发现什么 | PD-GB4 + hAstro 共培养组的侵袭水平比单独 PD-GB4 组提高了约 3 倍（P=0.009）；SEM 显示侵袭细胞伸出大量丝状伪足与基质纤维相互作用；P-选择素抑制剂显著降低了侵袭 |
| 说明什么 | 星形胶质细胞通过 P-选择素信号通路主动促进 GB 细胞侵袭，证明了肿瘤微环境中的基质细胞不是旁观者而是共谋者 |
图4→图5的逻辑：证明了模型能捕捉 TME 中的细胞互作后，需要进一步验证模型是否能模拟临床上的关键难题——替莫唑胺（TMZ）耐药性。
Figure 5：3D 模型中的 TMZ 耐药性——休眠与快速生长表型对比
图5：（A）T98G 和 U-87MG 细胞系的休眠（D）与快速生长（F）模型构建示意图；（B）体内肿瘤生长曲线：T98G-D 在 ~160 天后"逃逸"进入快速生长；（C-D）2D 培养中 F 和 D 表型无差异；（E-F）3D 环境中 F 组显著增殖和侵袭，D 组保持静止。
| 做了什么 | 比较了快速生长（F）和休眠（D）两种 GB 表型在体内（小鼠异种移植）、2D 培养和 3D 生物墨水中的生长、侵袭和对 TMZ 的药物反应 |
| 发现什么 | 在 2D 培养中 F 和 D 表型的增殖和侵袭完全一致（P>0.5）；但在体内和 3D 环境中，D 组生长极慢且对 TMZ 高度耐药，F 组快速生长且对 TMZ 敏感；3D 模型中的药物反应与体内结果高度一致，而 2D 完全无法预测 |
| 说明什么 | 3D 微环境是决定 GB 细胞药物敏感性的关键因素——2D 培养中的"有效药物"在 3D/体内模型中可能完全无效，这解释了为什么大量在 2D 中有效的候选药物在临床上失败 |
Figure 6：3D 环境中 P-选择素表达上调
图6：流式细胞术直方图对比 2D 培养（黑色）和纤维蛋白 3D 生物墨水（红色）中 P-选择素的表达水平。三个标志物均显示 3D 组信号显著右移。
| 做了什么 | 用流式细胞术定量检测 GB 细胞在 2D 培养 vs 3D 纤维蛋白生物墨水中 P-选择素及相关标志物的蛋白表达水平 |
| 发现什么 | 三个检测标志物均显示：3D 生物墨水中的 P-选择素表达量显著高于 2D 培养（直方图大幅右移），而同型对照和 2D 组几乎重叠 |
| 说明什么 | 3D 微环境本身就能诱导 GB 细胞上调侵袭相关蛋白的表达，这从分子水平证实了 3D 培养比 2D 更能激活肿瘤的真实生物学状态 |
图6→图7的逻辑：蛋白水平的差异已经证实，接下来需要从全基因组转录层面系统评估 3D 模型在多大程度上"像"真实脑组织。
Figure 7：转录组学验证——3D 模型更接近体内脑组织
图7：（A）PCA 主成分分析：2D（橙色）、3D（绿色）、脑组织（蓝色）三组明显分离；（B）热图显示组内相似度高（蓝色对角线），组间差异大；（C-F）关键基因（Lrpap1, Socs7, VCAM-1, IRF1 等）表达量：3D 组（红色）普遍高于 2D 组（灰色），部分基因接近体内脑组织水平（黑色）。
| 做了什么 | 对 2D 培养的 GB 细胞、3D 生物墨水中的 GB 细胞和体内小鼠脑组织进行 RNA-seq 转录组测序，进行 PCA 分析和差异基因表达比较 |
| 发现什么 | PCA 显示三组完全分离（PC1 贡献 56% 方差）；3D 模型中多个与脑微环境相关的基因（Lrpap1、Socs7、VCAM-1、IRF1）表达量显著高于 2D，部分基因（如 B2m、IRF1）的表达水平接近体内脑组织 |
| 说明什么 | 3D 生物打印模型在转录组水平上比 2D 培养更接近真实脑组织的分子特征，为"3D 模型更适合药物筛选"提供了全基因组证据 |
三、说明什么 💡
核心结论链条
| 发现 | 意义 |
|---|---|
| 3D 模型中星形胶质细胞促进 GB 侵袭（P=0.009） | 肿瘤微环境中的基质细胞是药物耐药的关键驱动因素 |
| 2D 培养无法区分 TMZ 敏感/耐药表型，3D 可以 | 2D 药物筛选结果不可靠，是临床转化失败的重要原因 |
| 3D 模型转录组更接近体内脑组织 | 3D 生物打印模型可作为体内实验的有效替代/预筛平台 |
领域影响
这篇论文解决了一个长期困扰肿瘤药物开发的核心矛盾：为什么大量在体外有效的候选药物在临床上失败？ 答案很直接——因为体外用的 2D 培养根本不像肿瘤。
研究团队用一套完整的 3D 生物打印血管化 GB 模型，从细胞行为（侵袭）、药物反应（TMZ 耐药）和分子水平（RNA-seq）三个维度证明了 3D 模型比 2D 更接近真实肿瘤。这对神经肿瘤药物筛选、个性化用药指导有直接的转化价值。
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| CELLINK / BIO X 系列 | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 本文使用的 3D-Bioplotter 可被 CELLINK BIO X 直接替代。纤维蛋白/明胶生物墨水 + 牺牲墨水打印血管通道是 BIO X 的典型应用场景 |
| 3Brain HD-MEA | ⭐⭐⭐ | 本文的 3D GB 模型可用于 3Brain MEA 记录肿瘤细胞的电生理活动（如钙信号、侵袭相关电信号），补充本文缺失的功能性读数维度 |
| Celvivo Clinostar | ⭐⭐⭐ | 本文使用的蠕动泵灌注系统可被 Clinostar 旋转生物反应器替代，实现更均匀的剪切力分布和更大规模的 3D 肿瘤模型培养 |
参考文献
- Kolesky DB, Homan KA, Skylar-Scott MA, Lewis JA. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proc Natl Acad Sci USA. 2016;113(12):3179-3184. doi: 10.1073/pnas.1521342113
- Bhattacharjee S, Lee SH. 3D bioprinting of cancer models for drug screening. Bioprinting. 2021;23:e00162. doi: 10.1016/j.bprint.2021.e00162
- Costa EC, Moreira AF, Almeida-de-Sousa I, et al. 3D bioprinting: a powerful tool for the recapitulation of the tumor microenvironment. Adv Healthc Mater. 2021;10(18):e2100540. doi: 10.1002/adhm.202100540
- Longoni A, Bulato M, Iazzoni G, et al. 3D bioprinting of glioblastoma: state of the art and future perspectives. Cells. 2022;11(13):2085. doi: 10.3390/cells11132085
转发语：Science Advances 重磅——3D 生物打印血管化胶质母细胞瘤模型，从基因表达到药物耐药全面碾压 2D 培养，给神经肿瘤药物筛选提供了一个真正靠谱的体外平台。
联系人：李东伟
📞 18045130660 🌐 https://www.biokingdom.top