CelVivo 网络研讨会中文转录稿

演讲：体外疾病模型——从复杂性到治疗

演讲者：Doris Wilflingseder 教授，因斯布鲁克医科大学卫生与医学微生物学研究所
原始视频：https://www.youtube.com/watch?v=I4T68skTaNU
起始时间：24:54（1494 秒）

中文转录稿（从 24:54 开始）

CelVivo ClinoStar 类器官培养系统介绍

我们使用的另一个系统是肺类器官，它们通常在培养基中以基底朝外的方式生长，顶端朝向中心。正如你在这里看到的，我们筛选了 SARS-CoV-2 受体 ACE2 和 TMPRSS2，可以看到它们位于中心区域——TMPRSS2 呈粉色，ACE2 呈橙色。我们还使用 ZO-1 染色了紧密连接，细胞核染成蓝色。

在第一波新冠疫情期间，我们发现了一个已发表的方案，可以将这些类器官的极性翻转为顶端朝外（apical-out）的表型。我们尝试了这个方案，效果非常好，现在我们有了顶端朝外的类器官，正如你从纤毛摆动和基底朝内所看到的。这也更符合感染这些肺类器官的生理状态。

因此，我们拥有这两个互补的系统：一方面是更接近生理状态的气液界面模型，可以轻松引入免疫细胞；另一方面是类器官系统，更适合高通量筛选。

CelVivo vs Matrigel：无动物源性成分培养

在这个系统中，我们也希望去除所有动物源性成分。众所周知，类器官通常在 Geltrex 或 Matrigel 中培养，这些都来自动物源。因此，我们直接比较了两种方法：

• Geltrex/Matrigel 培养
• CelVivo ClinoStar 培养——无需任何支架材料

CelVivo 使用的是生物反应器，在培养箱内旋转运动，你还可以调整生物反应器的运动方式，因此细胞始终处于运动状态，能够轻松地自组织。

我们直接与所谓的"金标准"进行了比较，并观察了基底细胞和顶端细胞在 Geltrex 与 CelVivo 中的表现。我们发现：

CelVivo 的优势

1. CelVivo 在纤毛细胞分化方面更优
2. 基底细胞表现相似，无显著差异
3. 在 CelVivo 中，细胞分化效果更好

这只是非常粗略的概述，但我们最近进行了更多特征分析和比较。我们发现：

• 近似分化的类器官在 CelVivo 中生长更好
• 生长速度更快
• 纤毛细胞更多
• 黏液产生细胞表达也更高

因此，特别是对于我们持续进行的实验，需要大量类器官时，我们更倾向于使用 CelVivo 培养的类器官，无需任何额外基质。

两个互补系统的优势

正如我之前告诉你的，这两个系统很好地互补：

• 气液界面模型：更生理化的条件
• 类器官模型：适合高通量筛选

新冠感染研究结果

在过去的几年里，特别是在新冠疫情初期，我们从诊所获得了首批新冠患者的分离株，我们提出了几个问题。我们想知道，在什么都还不知道的时候，SARS-CoV-2 进入呼吸道组织后，屏障位点究竟发生了什么。

组织破坏与黏液过度分泌

我们发现：

• 左侧：未感染的组织
• 右侧：SARS-CoV-2 感染的组织

SARS-CoV-2 感染的人类原代呼吸道上皮细胞显示出广泛的组织破坏。我们还测量了 TEER 值，这些感染组织的值显著低于未感染的组织。

我们还发现了一个非常有趣的现象：黏液过度分泌。你可以看到这里有大量的黏液分泌区域和黏液栓形成，当然还有感染细胞、病毒颗粒以及上皮破坏。而这里你可以看到正常的黏液产生——你可以看到一些黏液产生细胞，但永远不会看到这种黏液过度分泌。

黏液过度分泌在重症新冠患者中也有描述。因此我们认为，这个相对简单的系统（仅由分化的上皮细胞组成）很好地反映了新冠患者屏障位点发生的情况。

Delta vs Omicron 变异株对比

在新时代，我们想看看感染 Delta 和 Omicron 时发生的差异：

• Delta：真正穿透到了伪复层上皮的基底外侧
• Omicron：感染仅发生在上皮表面

我们发现 Delta 感染导致病毒颗粒深度穿透到基底侧，而 Omicron 仅破坏了上层细胞，而 Delta 造成了大规模的组织破坏。

然后我们测量了病毒颗粒从上皮侧的距离，Delta 显著高于我们测试的所有 Omicron 变异株。

先天免疫激活

我们还发现，原始的 SARS-CoV-2 变异株（如野生型、Delta）确实也引起了非常高的先天免疫激活，表现为补体 C3 释放到上皮的基底侧。这也当然会引起免疫细胞迁移到感染部位，导致组织炎症。

因此，我们想知道是否可以阻止这种反应，是否可以通过添加补体受体抑制剂来阻止这种先天免疫激活。

补体抑制剂的惊人效果

正如你在这里看到的，C5a 受体抑制剂效果最好。你可以看到，加入抑制剂后，组织中的炎症反应几乎消失了，组织看起来与未感染的组织非常相似。

令人惊讶的是，抑制炎症反应的同时，病毒载量也显著下降了。正如你在这里看到的，感染组织中病毒呈红色，而加入 C5a 受体抑制剂后，病毒载量显著降低。

我们还通过定量分析确定了病毒载量，发现抑制剂处理的样本中病毒载量也显著降低。我们还发现黏液分泌显著减少。

这种上皮细胞内最初先天免疫反应的阻断，也与其他促炎细胞因子的显著下调相关，这些细胞因子与重症新冠病例中观察到的细胞因子风暴有关。

因此，我们提出：在感染初期抑制补体，也可能有助于下调细胞因子风暴。

这也与意大利在新冠第一波疫情期间对患者的治疗相吻合——当时还没有新冠疫苗，所以我们真的不知道如何阻止这种情况。因此意大利有病例报告显示，他们添加了补体抑制剂，从而成功挽救了患者的生命。

个性化中和试验

正如我之前展示的，我们还进行了一项关于血清和唾液中和作用的队列研究。这将形成一个个性化的保护性试验，因为我们可以确定疫苗是否有效，以及是否对新的变异株也有效。

我们使用了来自以下患者的血清和唾液：

• 三次疫苗接种后感染 Omicron BA.4/5 的患者
• 三次疫苗接种后接种二价加强针的患者

在最后一次免疫后 5-7 周，我们采集了这些患者的血清和唾液。我们想知道是否能从唾液或血清中观察到对 SARS-CoV-2 变异株的中和作用。

我们发现：

• 高滴度组的唾液样本（深蓝色显示）在所有个体中将病毒滴度降至零，并保持了组织完整性
• 高滴度血清部分减少了病毒颗粒，也提高了组织完整性

因此，我们可以说，这个系统也可用于以个性化方式测试 IgA 或 IgG 在中和能力方面的容量。

添加免疫细胞的新方向

正如我开头告诉你的，我们现在也有了新的分析，我们向系统中添加了免疫细胞，现在可以观察免疫系统侧发生了什么。这是我们目前正在研究的方向。

问答环节

Q1：使用 ClinoStar 生成顶端朝外类器官的具体方案是什么？

答：在 ClinoStar 中，我们改变培养基组成以获得顶端朝外的表型。我们将类器官在这种培养基中保留1-2 周，就能获得近似分化的表型。我们不仅检查了这里展示的标记物，还检查了更多标记物。我们还比较了 Geltrex vs 动物游离支架 vs ClinoStar。我们正在撰写这篇论文，很快会发表。如果需要方案，也可以直接给我发邮件。

Q2：你们的研究是否探索了 SARS-CoV-2 感染后纤毛摆动模式的潜在改变？

答：是的，我们无法进行活细胞分析，但从显微镜检查中我们发现纤毛摆动有所不同。我们特别看到的是高黏液分泌——这与黏液栓形成同步发生。

另外，关于纤毛和纤毛摆动，我们还用 commercially available 的抗病毒喷雾处理了这些滤器，我们发现处理组纤毛摆动速度显著加快。我认为这反映了纤毛可能通过更快摆动将病毒排出系统，或通过更快的摆动以某种方式阻止病毒颗粒附着到靶细胞上。这个分析非常有趣，因为我们可以在活细胞模式下进行——我们只需添加荧光标记的微珠，用抗病毒喷雾或对照组分处理细胞，然后观察黏液纤毛清除率。在这种模式下，纤毛速度确实显著高于对照孔。

Q3：你们在 SARS-CoV-2 研究中使用了哪种 3D 细胞培养模型？

答：我们使用了两种模型——肺类器官（特别是顶端朝外极化的类器官）和气液界面模型。我们总是在两个模型中进行检查。我们还使用了不同来源的模型——鼻来源、上呼吸道来源、下呼吸道来源。所以我们在疫情初期对 SARS-CoV-2 与呼吸道上皮细胞的相互作用还不太了解时，使用了从鼻子到肺的所有不同模型。

关键要点总结

1. CelVivo ClinoStar 系统在类器官培养中优于传统 Matrigel/Geltrex

   • 纤毛细胞分化更好
   • 生长速度更快
   • 无需动物源性支架
   • 细胞自组织，始终处于运动状态

2. 气液界面模型与类器官模型互补

   • 气液界面：更生理化，可引入免疫细胞
   • 类器官：适合高通量筛选

3. 新冠感染模型揭示了重要的病理机制

   • 组织破坏
   • 黏液过度分泌与黏液栓形成
   • Delta 比 Omicron 穿透更深
   • 补体系统在先天免疫激活中的关键作用

4. 补体抑制剂（C5aR 抑制剂）的潜在治疗价值

   • 显著降低炎症反应
   • 显著降低病毒载量
   • 减少黏液分泌
   • 下调促炎细胞因子

5. 个性化中和试验平台

   • 可测试血清/唾液的中和能力
   • 可评估疫苗对新变异株的有效性
   • 可比较 IgA 与 IgG 的中和效果