人iPSC来源海马体类球体——分层阿尔茨海默病患者特异性细胞表型与开发疗法的新工具
Pomeshchik et al. | Cellular | DOI: 10.1016/j.stemcr.2023.08.009
标签: #海马体类球体 #阿尔茨海默病 #iPSC疾病建模 #全细胞膜片钳 #FTIR蛋白聚集 #蛋白质组学 #基因治疗
一、做什么 🔬
核心问题
阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，海马体是最早受累的脑区之一。既往 AD 研究多基于转基因小鼠模型或死后脑组织，但这些模型无法完全重现人类 AD 的细胞病理学特征。诱导多能干细胞（iPSC）衍生的 3D 类器官为在人类细胞背景下研究 AD 病理提供了新机会，但现有的海马体类器官分化方案耗时长且需要共培养。
研究设计
研究者开发了一种新型 hiPSC 来源海马体类球体（HSs）分化方案，使用 APP 变异（p.V717I 纯合子）和 PS1 变异（p.R278K）的家族性 AD 患者 iPSC，以及性别匹配的对照 iPSC，在 100 天体外培养（DIV）后系统评估了多种 AD 相关病理表型：
| 分析维度 | 方法 | 目的 |
|---|---|---|
| Aβ 肽段分析 | MSD 多阵列检测 Aβ38/40/42 比值 | 评估淀粉样蛋白代谢异常 |
| Tau 磷酸化 | Western blot（AT8 抗体）+ 免疫荧光 | 评估神经原纤维缠结早期标志物 |
| 突触蛋白 | Western blot 检测 synaptophysin、drebrin、PSD-95 | 评估突触病理（AD 早期形态学变化） |
| 神经元形态学 | 免疫染色定量胞体面积、神经突长度、树突复杂度 | 评估神经元退化 |
| 全细胞膜片钳 | 记录动作电位、钠电流、钾电流 | 评估神经元电生理功能 |
| miRNA 表达 | RT-PCR 检测 miR-125b、miR-124、miR-21、miR-29a/b | 评估 miRNA 调控网络失调 |
| 蛋白聚集 | 同步辐射 FTIR 光谱分析 β-折叠结构 | 检测蛋白质构象变化和聚集 |
| 蛋白质组学 | LC-MS/MS 定量 >10000 个蛋白 | 全局蛋白质表达谱比较 |
| 基因治疗验证 | ND1（奈瑟菌属来源蛋白）体外基因治疗 | 探索潜在治疗策略 |
为什么值得读
这篇论文首次系统比较了两种家族性 AD 变异（APP vs PS1）在同一海马体类球体模型中的病理表型差异。核心发现：虽然两种变异都增加了 Aβ42/Aβ40 比值，但只有 APP 变异出现了 Tau 磷酸化增加、β-折叠结构增加和蛋白聚集——说明不同 AD 基因变异的细胞病理学轨迹不同。这对于理解 AD 异质性和开发精准治疗具有重要意义。
二、发现什么 📊
Figure 1：hiPSC 来源海马体类球体的生成与表征
图1：hiPSC 来源海马体类球体（HSs）的分化方案与表征。(A) 分化方案基于胚胎体（EB）培养，使用双 SMAD 抑制剂（LDN-193189 + SB-431542）指定背侧端脑前体，CHIR99021（WNT 激活剂）+ BDNF 指定海马体身份。(B) 30 DIV 的 EB 几乎全部由 LEF1+ 细胞组成，表明已向内侧掌板组织区域化。(C-F) 免疫染色显示：MAP2+ 神经元为主，GFAP+ 星形胶质细胞<2%，O4+ 少突胶质细胞缺失；ZBTB20+ 和 PROX1+ 细胞分别占45-60%和45-60%，表明海马体身份；PAX6+、TBR1+、calretinin+、calbindin+ 细胞共存，表明不同成熟阶段。(G-H) 移植到成年 RAG-1 缺陷小鼠海马体后 5 周，供体细胞（人类核+）共表达 ZBTB20/PROX1 和 doublecortin/calretinin，确认海马体身份。(I-K) 100 DIV 的 HS 大而完整，主要由 MAP2+ 神经元组成，含 synaptophysin+ 突触前点在 MAP2/PROX1+ 神经元表面。
| 做了什么 | 发现什么 | 说明什么 |
|---|---|---|
| 建立新型 hiPSC 分化方案（双 SMAD 抑制 + WNT 激活 + BDNF）生成海马体类球体 | 30 DIV 的 EB 几乎全为 LEF1+ 内侧掌板前体；100 DIV 时含大量 MAP2+ 神经元、ZBTB20+ 和 PROX1+ 海马体标志细胞，突触前 synaptophysin+ 点在神经元表面形成 | 该方案能在~100 天内生成具备海马体身份和突触形成的 3D 类球体，比现有方案更快速且无需共培养 |
| 体内移植验证（小鼠海马体） | 移植 5 周后供体细胞共表达 ZBTB20/PROX1 和 doublecortin/calretinin | 体内验证确认了 HS 的海马体神经元身份 |
Figure 2：APP 和 PS1 变异 HS 均展现 AD 相关病理——Aβ42/Aβ40 比值升高
*图2：APP 和 PS1 变异 HS 的 AD 病理表征。(A-B) Aβ 积累（细胞内 Aβ，a）和分泌（细胞外 Aβ，b）在 100 DIV 的 APP 变异、PS1 变异和性别匹配对照 HS 中。Aβ42/Aβ40 比值在 HS 裂解液（A）和培养基（B）中均升高——PS1 变异约 1.5 倍，APP 变异约 2 倍。独立分化 n=3，*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。(C-D) 100 DIV HS 的 tau 蛋白磷酸化 Western blot（AT8 抗体），actin 为内参。37 kDa 磷酸化 tau 异构体在 APP 变异中显著高于对照。(E) Synaptophysin（突触前）和 drebrin（突触后）免疫染色显示突触接触形成。(F-G) 突触蛋白定量：synaptophysin 和 drebrin 在 APP 和 PS1 变异 HS 中均显著低于对照，PSD-95 无变化。
| 做了什么 | 发现什么 | 说明什么 |
|---|---|---|
| MSD 多阵列检测 Aβ38/40/42 肽段 | APP 变异和 PS1 变异的 Aβ42/Aβ40 比值均升高（APP ~2 倍，PS1 ~1.5 倍），主要由 Aβ42 水平增加驱动 | 两种 AD 变异都影响了淀粉样蛋白代谢，但 APP 变异的影响更显著——与其纯合子 p.V717I 突变一致 |
| Western blot 检测 tau 磷酸化（AT8 抗体） | 37 kDa 磷酸化 tau 异构体在 APP 变异 HS 中显著高于对照，PS1 变异无显著差异 | APP 变异更早出现 Tau 病理，提示不同 AD 变异的病理进展速度不同 |
| 检测突触蛋白（synaptophysin、drebrin、PSD-95） | Synaptophysin 和 drebrin 在两种变异中均显著降低，PSD-95 无变化 | 突触病理是 AD 的早期标志——突触前（synaptophysin）和突触后（drebrin）均受损，但突触后密度蛋白（PSD-95）在早期阶段保持不变 |
图2→图3的逻辑：Figure 2 在类球体水平证明了 AD 病理，接下来需要在单神经元水平验证这些表型是否存在于年轻神经元中。
Figure 3：APP 变异海马体神经元展现显著的电生理和形态学改变
图3：APP 变异海马体神经元的显著改变。(A-B) 磷酸化 tau 蛋白（AT8）免疫染色在 56 DIV 的海马体神经元中。APP 变异的 AT8+/MAP2+ 神经元比例显著高于对照，PS1 变异无差异。(C-F) 形态学分析：APP 变异神经元的胞体面积（D）、神经突长度（E）和树突复杂度（F）均显著低于对照，PS1 变异无差异。(G-L) 全细胞膜片钳记录：(G) 膜片钳记录中的 PROX1+ 神经元（充满生物素）；(H-I) APP 变异神经元在电流注入时产生的动作电位（AP）数量显著少于对照；(J) AP 特征分析显示 APP 变异有更去极化的阈值和更低的振幅；(K-L) TTX 敏感的钠电流峰值在 APP 变异中显著降低，TEA 敏感的钾电流无变化。(M-P) miRNA 表达：miR-125b 在两种变异中均上调（M），miR-124（N）和 miR-21（O）在两种变异中均下调，miR-29a 在 APP 变异中下调、在 PS1 变异中上调（P）。
| 做了什么 | 发现什么 | 说明什么 |
|---|---|---|
| 免疫染色检测磷酸化 tau（AT8）在 56 DIV 神经元中的比例 | APP 变异的 AT8+/MAP2+ 神经元比例显著高于对照，PS1 变异无差异 | Tau 磷酸化在 APP 变异中更早出现，与 Figure 2 的 Western blot 结果一致 |
| 形态学定量（胞体面积、神经突长度、树突复杂度） | APP 变异的胞体更小、神经突更短、树突分支更少；PS1 变异无差异 | APP 变异神经元的结构发育受损，这可能影响其功能 |
| 全细胞膜片钳记录动作电位和离子电流 | APP 变异神经元产生的 AP 数量显著减少，AP 阈值更去极化、振幅更低；TTX 敏感的钠电流峰值显著降低；钾电流无变化 | APP 变异神经元兴奋性下降——钠电流减少导致 AP 发放减少，这是神经元功能退化的直接证据 |
| RT-PCR 检测 AD 相关 miRNA（miR-125b、miR-124、miR-21、miR-29a/b） | miR-125b 上调（与 AD 患者 CSF 一致）；miR-124 和 miR-21 下调；miR-29a 在 APP 中下调、PS1 中上调 | miRNA 调控网络在两种变异中部分共享（miR-125b/124/21），但也有差异（miR-29a）——提示不同变异有不同的转录后调控模式 |
Figure 4：APP 变异 HS 中蛋白聚集增加——FTIR 光谱分析
核心发现（本文使用 FTIR 同步辐射光谱分析蛋白构象变化）：
| 做了什么 | 发现什么 | 说明什么 |
|---|---|---|
| 同步辐射 FTIR 光谱分析 HS 中的 Amide I 带（1600-1700 cm⁻¹）二阶导数 | APP 变异 HS 的 β-折叠结构含量显著高于对照，PS1 变异无差异 | 尽管两种变异都增加了 Aβ42/Aβ40 比值，但只有 APP 变异发生了蛋白聚集——β-折叠是淀粉样蛋白聚集的标志性构象 |
| 分离 HS 生成神经元单层培养，检测神经元中的蛋白聚集 | 神经元中也观察到 β-折叠增加 | 蛋白聚集不仅发生在类球体整体水平，也发生在神经元特异性层面 |
| 生成星形胶质细胞单层培养（从 HS 前体分化） | 星形胶质细胞中也检测到蛋白聚集 | 蛋白聚集不仅限于神经元，星形胶质细胞也参与 AD 病理 |
图4→图5的逻辑：Figure 4 证明了 APP 变异有蛋白聚集，接下来需要从全局蛋白质组学层面理解分子机制。
Figure 5：蛋白质组学揭示 APP 和 PS1 变异的独特蛋白质特征
图5：HS 的定量蛋白质组学分析。(A) 韦恩图显示四种基因型中共有的蛋白数量；(B) 主成分分析（PCA）确认 HS 按性别（PC1）和基因型（PC2）分离；(C-D) 差异表达蛋白分析；(E) 功能富集分析显示 APP 和 PS1 变异的独特通路特征。
| 做了什么 | 发现什么 | 说明什么 |
|---|---|---|
| LC-MS/MS 定量 >10000 个蛋白，比较 APP、PS1 和对照 HS | PCA 显示 HS 按性别（PC1）和基因型（PC2）分离 | 蛋白质组学能准确区分不同基因型的 HS，证明了该模型的可靠性 |
| 差异表达蛋白功能富集分析 | APP 和 PS1 变异的差异蛋白富集于不同通路 | 两种 AD 变异的分子病理学轨迹不同——APP 变异更偏向淀粉样蛋白加工和 Tau 磷酸化通路，PS1 变异更偏向其他通路 |
Figure 6：ND1 体外基因治疗调节 AD 相关基因转录
图6：ND1 体外基因治疗对转录的调节。(A-C) ND1 处理后差异表达基因的火山图和热图；(D-E) 基因本体论（GO）富集分析显示 ND1 调节的通路包括突触功能、轴突发育和 AD 相关通路。
| 做了什么 | 发现什么 | 说明什么 |
|---|---|---|
| 使用 ND1（奈瑟菌属来源蛋白）对 HS 进行体外基因治疗 | ND1 处理调节了数百个基因的转录，富集于突触功能、轴突发育和 AD 相关通路 | ND1 基因治疗能逆转部分 AD 相关的转录异常——为未来 AD 治疗提供了新思路 |
三、说明什么 💡
核心结论
| 发现 | 机制意义 |
|---|---|
| APP 和 PS1 变异都增加 Aβ42/Aβ40 比值 | 两种变异都影响淀粉样蛋白代谢，但程度不同（APP ~2 倍，PS1 ~1.5 倍） |
| 只有 APP 变异出现 Tau 磷酸化增加、β-折叠增加和蛋白聚集 | 不同 AD 基因变异的病理轨迹不同——APP 纯合子变异导致更严重的蛋白病理 |
| APP 变异神经元形态学退化、动作电位减少、钠电流降低 | 神经元功能退化与结构退化一致——兴奋性下降是 AD 早期电生理标志 |
| miRNA 网络部分共享（miR-125b/124/21），部分不同（miR-29a） | 不同变异有不同的转录后调控模式 |
| ND1 基因治疗能调节 AD 相关转录通路 | 为基因治疗提供了体外验证平台 |
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| 3Brain HD-MEA | ⭐⭐⭐ | 本文使用全细胞膜片钳评估神经元电生理功能，3Brain HD-MEA 可提供更高通量的网络级电生理分析，适用于评估类球体中多个神经元的同步活动和网络动态 |
| CELLINK BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐ | 海马体类球体的 3D 培养需要精确的基质胶封装和长期培养，CELLINK 生物打印可用于构建标准化的类球体培养体系，提高批次间一致性 |
| Celvivo Clinostar2 | ⭐⭐⭐⭐ | 类球体的长期培养（100 DIV）需要稳定的环境控制，Celvivo 的自动化系统可用于长期监测类球体的形态和功能变化 |
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📄 Pomeshchik Hippocampal Spheroids AD modeling.pdf
参考文献
- Pomeshchik Y, Klementieva O, Gil J, et al. Human iPSC-Derived Hippocampal Spheroids: An Innovative Tool for Stratifying Alzheimer Disease Patient-Specific Cellular Phenotypes and Developing Therapies. Cellular. DOI: 10.1016/j.stemcr.2023.08.009
- Pasca AM, et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 2015;12:671-678. DOI: 10.1038/nmeth.3415
- Sakaguchi H, et al. Generation of functional human cortical spheroids from iPSCs. Molecular Psychiatry. 2015;20:1-12. DOI: 10.1038/mp.2015.139
- Klementieva O, et al. Infrared microspectroscopy for the detection of protein aggregation in neurodegenerative diseases. Methods in Molecular Biology. 2017;1609:247-261. DOI: 10.1007/978-1-4939-7003-0_18
转发语：这篇用 hiPSC 海马体类球体系统比较了 APP 和 PS1 两种家族性 AD 变异的病理轨迹——虽然都增加了 Aβ42/Aβ40 比值，但只有 APP 变异出现了 Tau 磷酸化和蛋白聚集。全细胞膜片钳证明 APP 变异神经元的钠电流减少、动作电位下降。iPSC 疾病建模 + 多组学分析是精准 AD 研究的新范式。
联系人：李东伟
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