人基底前脑类器官的生成及在移植组装体中与皮层胆碱能投射的功能连接
期刊: Cell Stem Cell, 2025
IF: ~20.4
DOI: 10.1016/j.stem.2025.10.004
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作者: Da Wang, Xinyue Zhang, Xiao-Yan Tang, Yixia Gan, Hanwen Yu, Shanshan Wu, Yuan Hong, Mengdan Tao, Chu Chu, Xiaoxuan Qi, Hao Hu, Yimin Zhu, Wanying Zhu, Xiao Han, Min Xu, Yi Dong, Qing Cheng, Xing Guo, Yan Liu
机构: 南京医科大学, 华东师范大学, 南京医科大学附属妇产医院, 中国
核心科学问题
如何在体外生成人类基底前脑迈内特核（nbM）类器官，并建立与皮层的功能性胆碱能投射连接？
研究背景：
- nbM 是大脑主要的胆碱能输出源，调控皮层活动、学习和记忆
- nbM-皮层胆碱能通路功能障碍与阿尔茨海默病（AD）和唐氏综合征（DS）的认知缺陷密切相关
- 缺乏体外模型研究 nbM-皮层环路的发育和功能障碍
技术方案
分化方案
- hPSC → nbM 类器官（hnbMO）：SHH（750 ng/mL）+ Purmorphamine → MGE 祖细胞 → NGF 促进 CHN 分化（day 63）
- hPSC → 皮层类器官（hCO）：作为靶标组织
- 组装体（Assembloid）：hnbMO + hCO 融合培养建立功能性连接
- 体内移植：hnbMO 移植到 SCID Beige 小鼠 nbM 区域，hCO 移植到皮层
表征方法
- 单细胞 RNA-seq：14,245 个细胞，鉴定 6 种细胞类型
- 免疫荧光：胆碱能标记物（CHAT, VACHT, NKX2.1, FOXG1）
- 光遗传学 + 膜片钳：功能性突触连接验证（oEPSC ~40 pA）
- HD-MEA（3Brain Accura Chip）：网络活动记录
- 钙成像：GCaMP6s 同步钙活动
- 狂犬病毒逆向标记：突触连接验证
- ACh 生物传感器（ACh3.0）：乙酰胆碱释放检测
- 体内双移植：hnbMO → nbM，hCO → 皮层，重建人源 nbM-皮层通路
实验数据
1. hnbMO 的生成与特征鉴定
图 1A：分化方案（SHH 750 ng/mL + Pur + NGF） | 图 1B：hnbMO 免疫荧光（CHAT, TUJ1, NKX2.1, FOXG1, NEUN, SOX2, VACHT，day 63） | 图 1C-E：scRNA-seq UMAP 显示 6 种细胞类型（RG-div, RGCs, IPCs, IMs, GABAs, CHNs），day 36→63 祖细胞从 63.5% 降至 20.5%，GABA 和 CHN 从 25.4% 增至 49.6% | 图 1F：VoxHunt 映射显示 hnbMO 与小鼠 MGE 高度相关 | 图 1G：转录组相似性分析显示 day 63 CHN 和 GABA 簇与人类胎儿 nbM（21 PCW）最高相关 | 图 1H：空间投影显示 hnbMO CHN 和 GABA 特异定位于人 GW16 胎儿脑 nbM 区域 | 图 1I：标记基因小提琴图
- NKX2.1+ 细胞 92.72% ± 0.766%（day 36）
- CHAT+ 在 NEUN+ 细胞中 38.13% ± 1.62%（day 63）
- VACHT+ 在神经元中 91.6%
- scRNA-seq 显示 CHAT+ 占 40.39%，RBFOX3+ 占 78.62%（day 63）
- 转录组与人类胎儿 nbM（21 PCW）最高相关，与其他 MGE 衍生核（MS, DBB）相关性低
2. hnbMO 的形态与功能成熟
图 2A-C：CHAT-tdTomato 报告细胞系，90% mCherry+ 细胞为 CHAT+ | 图 2D：day 100 CHN 具有典型投射神经元形态（长轴突和树突棘） | 图 2E-F：全细胞膜片钳记录，day 63 检测到 Na+/K+ 电流峰和动作电位 | 图 2G-H：ACh3.0 生物传感器检测 KCl 刺激后 ACh 释放（ΔF/F 增加） | 图 2I：GCaMP6s 钙成像，day 80 检测到同步钙事件 | 图 2J-K：HD-MEA（3Brain Accura Chip）记录 day 120 hnbMO 自发尖峰和网络同步（74 个细胞，13 个类器官）
- 膜片钳：去极化诱发 Na+ 和快 K+ 电流，自发和诱发动作电位
- ACh3.0：KCl（40 mM）刺激后 GFP 信号显著增加
- 钙成像：day 80 多个同步自发钙事件
- HD-MEA：day 120 检测到自发尖峰和网络级同步（n=13 类器官）
3. 体内移植与胆碱能投射
图 3A-C：hnbMO 移植到 SCID Beige 小鼠 nbM 区域 | T2 加权 MRI（2 个月）显示移植物精确定位在 nbM | 3D 重建确认位置 | 图 3D-G：6 个月后 ~3.5 mm 长距离投射束沿背外侧通路从移植物投射到宿主皮层 | S1、M1、BLA 丰富投射，CPu 和 HPC 稀疏，TH 和 HTH 极少 | 图 3H：人类突触（hSYN）在移植物中富集 | 图 3I：STEM121+ 纤维投射到小鼠皮层，紧密贴附小鼠锥体神经元树突，表达人类突触素（SYP） | 图 3J-K：移植 CHN 几乎不表达 GBX2，排除胆碱能中间神经元
4. nbM-皮层组装体体外表征
图 4A-B：nbM-皮层投射示意图 | 组装体融合方案 | 图 4C-E：GFP+ hnbMO 投射进入 hCO，20 daf 覆盖率达 22.51%，避开 hCO 的 VZ 区域 | 图 4F-G：狂犬病毒逆向标记，~60% mCherry+ 细胞为 CHAT+ CHN，证明突触连接 | 图 4H-I：光遗传 oEPSC 记录，daf 20 平均振幅 ~40 pA | 图 4J-K：钙成像显示 hnbMO 和 hCO 同步钙活动，东莨菪碱丁基溴化物显著抑制 hCO 钙活动（p < 0.001） | 图 4L-M：HD-MEA 记录，hnbMO 侧更多发送者，hCO 侧更多接收者（n=8 组装体） | 图 4N-O：ACh3.0 检测 KCl 刺激后 ACh 释放到 hCO
- 投射覆盖：daf 2（6.06%）→ daf 10 → daf 20（22.51%），p < 0.001
- 狂犬病毒逆向标记：~60% mCherry+ 细胞为 CHAT+
- 光遗传 oEPSC：~40 pA（n=7 组装体）
- 东莨菪碱丁基溴化物（毒蕈碱受体拮抗剂）显著抑制 hCO 钙活动（p < 0.001）
- HD-MEA：hnbMO 侧发送者多于 hCO 侧，hCO 侧接收者多于 hnbMO 侧（p < 0.01）
5. 组装体双移植重建人源 nbM-皮层通路
图 5A：双移植实验设计（hCO → 皮层，hnbMO → nbM） | 图 5B-D：6 个月后 mCherry+ hCO 和 GFP+ hnbMO 均良好存活 | hnbMO 衍生胆碱能投射广泛进入 hCO | 图 5E-F：hCO 投射到宿主脑多区域，遵循体内皮层投射模式 | 图 5G-H：4 个月后光遗传 oEPSC 记录，~20 pA，证明功能性突触形成
6. 唐氏综合征胆碱能投射缺陷建模
图 6：DS 来源组装体投射缺陷 | DS 来源 hnbMO CHAT 表达降低 | 投射减少 | 功能连接受损
- DS 来源 hnbMO CHAT 表达显著低于对照
- 投射能力受损
- 组装体连接缺陷模拟 DS 认知障碍的细胞基础
核心发现总结
| 发现 | 数据支持 |
|---|---|
| hnbMO 重现 nbM 特异性身份 | NKX2.1+ 92.7%, CHAT+ 40.4%, VACHT+ 91.6% |
| scRNA-seq 与人类胎儿 nbM 最高相关 | 21 PCW nbM 转录组相似性最高 |
| 体内移植形成 ~3.5 mm 长距离投射 | S1, M1, BLA 丰富投射 |
| 组装体形成突触连接 | oEPSC ~40 pA（体外），~20 pA（体内） |
| HD-MEA 显示网络同步 | hnbMO 侧发送者多，hCO 侧接收者多 |
| ACh 释放到 hCO | ACh3.0 检测 KCl 刺激后 ΔF/F 增加 |
| DS 模型投射缺陷 | DS 来源 CHAT 表达降低，投射减少 |
创新点
- 首个人类 nbM 类器官模型 — 重现 nbM 特异性胆碱能投射神经元
- nbM-皮层组装体 — 体外建立功能性长距离胆碱能投射
- 体内双移植 — 首次在移植模型中实现功能性 nbM-皮层通路
- HD-MEA 网络分析 — 3Brain Accura Chip 记录组装体网络活动
- 唐氏综合征建模 — 揭示 DS 认知障碍的胆碱能发育缺陷机制
- ACh 生物传感器 — 实时检测胆碱能突触传递
局限性
- 体外组装体仅模拟早期发育阶段
- 体内移植在免疫缺陷小鼠中进行，与人脑环境有差异
- 未展示认知功能改善的行为学证据
学术启示
本研究建立了首个功能性 nbM-皮层组装体模型，为阿尔茨海默病和唐氏综合征的胆碱能退化研究提供了新平台。
与产品的关联：
- 3Brain HD-MEA（Accura Chip） 用于记录 nbM-皮层组装体的网络级同步活动，揭示 hnbMO 侧为发送者、hCO 侧为接收者的功能连接模式
- Celvivo 3D 培养系统：适用于 nbM-皮层组装体的长期动态成像和培养
- 类器官组装体技术：是未来神经环路建模的重要方向
- ACh 生物传感器（ACh3.0） 与 HD-MEA 联用，可同时检测胆碱能释放和网络电活动
📢 一句话转发语：Cell Stem Cell 2025（IF ~20.4）：首个人类 nbM 类器官 + 皮层组装体模型——成功建立功能性胆碱能投射通路并移植到小鼠大脑，3Brain HD-MEA 揭示组装体网络同步特征，为阿尔茨海默病和唐氏综合征提供全新胆碱能退化研究平台。
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