3D 双光子脑成像揭示双氢青蒿素通过调节铁稳态发挥抗癫痫作用
期刊: Cell Chemical Biology, 2022, 29(3): 476-490
IF: ~7.0
DOI: 10.1016/j.chembiol.2021.12.006
PDF 原文: SeaFile 下载
作者: Chenwen Shao, Yani Liu, Zhangpeng Chen, Yajuan Qin, Xueao Wang, Xueting Wang, Chao Yan, Hai-Liang Zhu, Jing Zhao, Yong Qian
机构: 南京师范大学生命科学学院, 南京大学生命科学学院, 南京医科大学药学院
核心科学问题
癫痫脑中活性亚铁离子（Fe²⁺）的空间分布如何？双氢青蒿素（DHA）能否通过调节铁稳态发挥抗癫痫作用？
研究背景：
- 癫痫脑中总铁含量显著升高，但活性 Fe²⁺ 的分布状态不清楚
- Fe²⁺ 过量积累促进铁死亡（ferroptosis），导致神经元死亡
- 缺乏能够穿透血脑屏障（BBB）的 Fe²⁺ 荧光探针用于活体脑成像
- DHA（青蒿素衍生物）在抗癌中诱导铁死亡，但在正常神经元中显示神经保护作用
技术方案
FeP 探针设计
- 骨架：双氰基异佛尔酮（dicyanoisophorone），具有 BBB 穿透能力
- 识别策略：N-氧化物策略，Fe²⁺ 介导脱氧恢复 NIR 荧光
- 光学特性：
- 激发/发射：456/640 nm
- 双光子激发：880 nm（最大双光子吸收截面）
- 检测限：14.2 nM
- 响应时间：300 秒达饱和
高通量筛选
- 平台：FeP + 高内涵分析（HCA）
- 模型：KA（红藻氨酸）诱导的神经元应激
- 筛选库：天然产物（20 μM）
- 命中化合物：DHA（双氢青蒿素）最有效下调 Fe²⁺ 水平
表征方法
- 流式细胞术：细胞 Fe²⁺ 水平定量
- 双光子成像：原代海马神经元 Fe²⁺ 成像
- 3D 双光子活体成像：癫痫小鼠脑 Fe²⁺ 动态分布
- Seahorse XFe96：线粒体呼吸功能分析
- EEG-EMG 记录：Athena 系统记录癫痫脑电活动
- 透射电镜（TEM）：突触和线粒体超微结构
- Western Blot：GPX4、Ac-p53、TfR1、铁蛋白、LCN2、FPN
实验数据
1. FeP 探针体外表征
图 1A：FeP 与 Fe²⁺ 响应机制示意图 | 图 1B-C：FeP 对 Fe²⁺ 的剂量依赖性荧光响应（0-100 μM），线性范围 0-50 μM（R²=0.9953） | 图 1D：时间依赖性响应（300 秒饱和） | 图 1E：pH 稳定性（pH 3-12） | 图 1F：HPLC 分析证实 Fe²⁺ 介导脱氧 | 图 1G：光稳定性测试（4-48 小时） | 图 1H：双光子吸收光谱（880 nm 最大） | 图 1I：细胞毒性测试（SH-SY5Y 细胞，高达 1000 μM 无毒）
2. 细胞 Fe²⁺ 成像与高通量筛选
- Fe²⁺ 检测：KA 和谷氨酸处理导致 SH-SY5Y 细胞 Fe²⁺ 显著升高
- BPY（铁螯合剂）：显著抑制 Fe²⁺ 荧光信号
- 高通量筛选：DHA 最有效下调 KA 诱导的 Fe²⁺ 升高
- BBB 通透性：PAMPA-BBB assay 显示 DHA 具有良好 BBB 通透性
- 青蒿素类似物比较：DHA > 青蒿素 > 蒿甲醚 > 青蒿琥酯
3. DHA 调节铁稳态和抑制铁死亡
图 2A：双光子成像显示 KA 和谷氨酸诱导的原代海马神经元 Fe²⁺ 升高，DHA 预处理/后处理均抑制 Fe²⁺ 异常上调 | 图 2B：定量分析 | 图 2C：C11-BODIPY 检测显示 KA 导致脂质过氧化，DHA 共处理减轻 | 图 2D：JC-1 检测显示 KA 降低线粒体膜电位，DHA 恢复 | 图 2E-F：Seahorse 分析显示 KA 抑制线粒体呼吸和糖酵解，DHA 维持功能 | 图 2G：DHA 减少乳酸积累 | 图 2H：DHA 抑制 KA 诱导的钙离子内流 | 图 2I：DHA 保护突触结构，增加突触数量和长度 | 图 2J：Western Blot 显示 DHA 上调 GPX4，下调 Ac-p53 和 TfR1，上调铁蛋白
- 脂质过氧化：KA 导致异常积累，DHA 共处理减轻
- 线粒体功能：KA 抑制基础呼吸、ATP 产生、最大呼吸和备用呼吸，DHA 维持或改善
- 糖酵解：KA 部分抑制糖酵解能力，DHA 改善
- 钙稳态：DHA 抑制 KA 诱导的钙离子异常内流
- 突触保护：DHA 减轻突触长度损伤，增加突触数量
- 铁死亡调控：
- DHA 上调 GPX4（铁死亡关键蛋白）
- 下调 Ac-p53（促铁死亡）
- 下调 TfR1（铁摄取）
- 上调铁蛋白（铁储存）
4. 癫痫脑 Fe²⁺ 成像
图 3A：活体 3D 双光子成像实验设计 | 图 3B：正常小鼠与 KA 诱导癫痫小鼠脑 Fe²⁺ 分布对比 | 癫痫脑显示显著增强的 Fe²⁺ 荧光信号，DHA 处理减弱信号 | 图 3C：不同深度的 3D 双光子荧光图像（总深度 80 μm，每 5 μm 扫描） | 癫痫脑在 60 分钟后显示更强的荧光信号
- 活体成像：FeP 穿透 BBB，实现癫痫脑 Fe²⁺ 3D 动态成像
- KA 模型：癫痫脑 Fe²⁺ 显著高于正常对照
- DHA 处理：预处理和后处理均减弱 Fe²⁺ 信号
- 时间动态：FeP 注射后荧光信号逐渐减弱，癫痫脑衰减更慢
5. 透射电镜分析
图 4A：TEM 显示 DMSO 组突触复合体（红箭头）和健康线粒体（黄箭头） | KA 组突触丢失和线粒体扭曲 | DHA 处理组恢复突触和线粒体结构 | 图 4B：DCX+、NeuN+、GFAP+、Iba-1+ 细胞定量分析 | KA 导致神经元减少和胶质细胞增生，DHA 抑制胶质细胞异常增殖并保护神经元 | 图 4C：癫痫脑切片 3D 双光子荧光图像（80 μm 深度）
6. EEG 记录验证抗癫痫活性
图 5A：EEG 记录实验设计时间线 | 图 5B：Racine 量表评估行为癫痫 | KA 诱导明显抽搐和前肢收缩，DHA 共处理缓解症状 | 图 5C：代表性 EEG 轨迹（2 小时、30 秒、10 秒） | KA 产生显著癫痫尖峰，DHA 预处理减轻，后处理进一步抑制异常放电 | 图 5D-G：癫痫发作振幅（D）、持续时间（E）、线长度（F）和总 EEG 功率（G）分布 | DHA 显著降低所有参数（n=7 只小鼠）
- 海马切片 LFP 记录：DHA 显著降低事件率、平均持续时间、事件能量和峰峰值振幅
- 活体 EEG-EMG：DHA 预处理减轻癫痫尖峰，后处理进一步抑制异常放电
- 行为学：DHA 缓解 KA 诱导的抽搐症状
7. 分子机制
- LCN2（ Lipocalin-2）：KA 模型中显著上调，DHA 后处理显著抑制
- FPN（Ferroportin）：DHA 处理轻微上调，促进 Fe²⁺ 外排
- GPX4：DHA 上调，抑制铁死亡
- 信号通路：LCN2/FPN/GPX4 轴调控铁稳态和铁死亡
核心发现
| 发现 | 数据支持 |
|---|---|
| FeP 探针穿透 BBB | PAMPA-BBB 和活体成像证实 |
| 癫痫脑 Fe²⁺ 异常升高 | 3D 双光子成像直接观察 |
| DHA 下调神经元 Fe²⁺ | 流式细胞术和双光子成像 |
| DHA 抑制铁死亡 | GPX4 上调，脂质过氧化减少 |
| DHA 维持线粒体功能 | Seahorse 分析证实 |
| DHA 缓解癫痫症状 | EEG 和行为学双重验证 |
| LCN2/FPN/GPX4 轴 | Western Blot 和 RT-PCR 证实 |
创新点
- 首个 BBB 穿透 Fe²⁺ 双光子探针（FeP） — 实现活体脑 Fe²⁺ 3D 动态成像
- 首次直接观察癫痫脑 Fe²⁺ 异常升高 — 提供铁稳态失衡的直接证据
- 高通量筛选发现 DHA 抗癫痫潜力 — FeP + HCA 平台
- 3D 双光子活体成像验证 — 非侵入性实时监测 Fe²⁺ 动态变化
- 揭示 DHA 通过 LCN2/FPN/GPX4 轴调控铁稳态 — 抗癫痫新机制
局限性
- 仅测试 KA 和 PTZ 两种癫痫模型
- 未进行长期毒性评估
- DHA 的详细信号通路需进一步研究
学术启示
本研究首次利用双光子探针 FeP 实现活体癫痫脑 Fe²⁺ 3D 动态成像，直接证实癫痫脑 Fe²⁺ 异常升高，并发现 DHA 通过调节铁稳态发挥抗癫痫作用。
与产品的关联：
- 3Brain HD-MEA 可用于癫痫模型神经网络电生理表征
- 该研究证明了铁稳态成像在癫痫研究中的重要性
- DHA 作为抗癫痫候选化合物具有开发潜力
📢 一句话转发语：Cell Chem Biol 2022：首个 BBB 穿透 Fe²⁺ 双光子探针实现活体癫痫脑 3D 成像——直接证实 Fe²⁺ 异常升高，高通量筛选发现双氢青蒿素通过 LCN2/FPN/GPX4 轴调控铁稳态发挥抗癫痫作用。
联系人｜李东伟
📞 18045130660
🌐 主页：https://www.biokingdom.top