纤维束作为填料在生物打印中实现细胞各向异性
Heilig et al. | Advanced Healthcare Materials 2025 | DOI: 10.1002/adhm.202503767
标签: #各向异性 #3D生物打印 #纤维束 #骨骼肌 #细胞排列 #GelMA #PCL #CELLINK
一、做什么 🔬
核心科学问题：骨骼肌、心肌、肌腱和神经组织都是各向异性（anisotropic）组织，其功能高度依赖于细胞的定向排列（alignment）。然而，传统的挤出式生物打印通常使用细胞负载水凝胶（如 GelMA），打印出的结构往往是各向同性的，细胞随机分布，无法模拟天然组织的定向微环境。本文提出了一种新方法：将**微米级纤维束（Fibrillar Bundles）作为物理填料（Filler）**加入到 GelMA 生物墨水中，利用纤维的拓扑结构引导细胞沿特定方向排列，从而在 3D 打印组织中实现各向异性。
实验设计：
| 步骤 | 操作 | 关键技术 |
|---|---|---|
| 1 | 制备 PCL 纤维束（Fibrillar bundles） | 熔体静电纺丝（Melt-electrofibrillation）+ 激光切割，制备不同长度的 PCL 微纤维束 |
| 2 | 制备复合生物墨水 | 将 PCL 纤维束混入 GelMA 水凝胶中，优化比例以获得可打印性和细胞相容性 |
| 3 | 3D 生物打印 | 挤出打印包含纤维束的 GelMA 生物墨水，构建多层支架 |
| 4 | 细胞培养与评价 | 接种 C2C12 成肌细胞，评估细胞存活、排列（alignment）和分化（肌管形成） |
核心假设：PCL 纤维束在 GelMA 基质中形成定向的“骨架”，通过接触引导（Contact guidance）机制，促使 C2C12 细胞沿纤维方向伸长、排列并融合形成肌管。
图1：A 纤维束制造流程（PCL/PVAc 共混→熔体静电纺丝→激光切割）；B 不同长度纤维束（L1, L2, L3）的 SEM 表征；C 纤维束混入 GelMA 生物墨水；D 3D 打印出的含纤维束支架结构。
二、发现什么 📊
2.1 纤维束的制备与表征
做了什么：通过调节熔体静电纺丝参数和激光切割长度，制备了三种不同长度（L1, L2, L3）的 PCL 纤维束，并表征其微观形貌。
发现什么：
- 形貌：纤维束由大量微米级 PCL 原纤维组成，端部呈多孔网状结构（有利于细胞附着）。
- 尺寸可控：L1 (~600 μm), L2 (~700 μm), L3 (~900 μm)，长度分布均匀。
- 长径比高：纤维束具有高长径比，适合作为增强填料。
说明什么：该工艺可稳定生产标准化的纤维束填料，为生物墨水提供了物理基础。
图2：A 熔体静电纺丝原理示意图；B-E 纤维束的 SEM 图像，显示其由微纤维组成且端部多孔；F-H 不同长度纤维束的宏观形貌对比；I 长度统计分析。
2.2 复合生物墨水的流变学与打印性能
做了什么：评估添加不同浓度纤维束的 GelMA 生物墨水的流变性能（粘度、剪切变稀）和打印保真度。
发现什么：
- 粘度增加：添加纤维束显著提高了生物墨水的粘度，减少了挤出后的溶胀（swelling）。
- 打印精度提升：含纤维束的 GelMA 打印出的线条更直、边缘更清晰，多层结构坍塌风险降低。
- 细胞相容性：Live/Dead 染色显示，含纤维束组的细胞存活率 >90%，与纯 GelMA 组无显著差异，证明 PCL 纤维束无毒。
说明什么：纤维束不仅作为生物学引导线索，还作为流变学改性剂改善了 GelMA 的打印性能，解决了纯 GelMA 打印易坍塌的问题。
2.3 纤维束引导 C2C12 细胞定向排列
做了什么：在含纤维束的 GelMA 支架中培养 C2C12 成肌细胞，观察 3 天后的细胞形态和排列方向。
发现什么：
- 形态变化：打印后即刻，细胞呈圆形随机分布；培养 3 天后，细胞明显伸长并沿纤维束方向平行排列。
- 排列度量化：极坐标图（Rose plot）显示，含纤维束组细胞排列角度高度集中在 0°（纤维方向），而无纤维束组（对照组）细胞排列杂乱无章。
- 对齐度显著增强：统计学分析表明，纤维束组的细胞对齐度（Alignment %）显著高于对照组（p<0.001）。
说明什么：PCL 纤维束在 3D 水凝胶基质中成功建立了各向异性微环境，通过接触引导机制实现了细胞的大规模定向排列。
图3：A-C 打印后即刻与 3 天后的细胞形态对比（Cell tracker 染色），显示细胞从圆形变为沿纤维排列的长条形；D 极坐标图量化排列角度，证明纤维束显著提高了细胞对齐度。
2.4 肌管形成与分化
做了什么：诱导 C2C12 细胞分化，评估肌管（Myotube）形成情况（肌球蛋白重链 MHC 表达）。
发现什么：
- 肌管形态：含纤维束组形成的肌管更细长、更平行，且肌核沿肌管长轴排列。
- 分化标志物：Myosin MF20 免疫荧光染色显示，肌管沿纤维方向延伸，且表达强度与对照组相当或略高。
- 肌管宽度：纤维束上的肌管宽度较窄（~20-30 μm），而对照组较宽（~50 μm），说明纤维限制了横向扩展，促进了纵向伸长。
说明什么：纤维束不仅引导了细胞排列，还促进了更成熟的肌管形态形成，这对于模拟骨骼肌功能至关重要。
图4：A 2D 对照与 3D 纤维束组的细胞骨架（Actin）对比，显示 3D 组细胞高度定向；B 肌管形成（Myosin MF20 染色，绿色）；C-D 肌核排列量化，证明肌管沿纤维方向高度对齐。
2.5 多层打印与深层组织各向异性
做了什么：打印多层（>5 层）含纤维束的 GelMA 支架，评估深层细胞的排列情况，验证该方法在构建大体积组织中的可行性。
发现什么：
- 深层排列一致性：共聚焦显微镜 Z-stack 扫描显示，即使在支架深层（>500 μm），细胞依然沿纤维束方向排列，未出现各向同性化。
- 营养扩散：纤维束之间的空隙（porosity）允许培养基渗透，支持深层细胞存活。
说明什么：该方法不仅适用于单层结构，还能在厚组织构建中维持各向异性，克服了传统水凝胶打印中深层细胞排列随机化的问题。
图5：A 生物墨水制备流程（GelMA + PCL Bundles + C2C12 混合，4°C 静置后打印）；B 细胞存活率对比（含纤维束组>90%）；C 打印后即刻细胞形态（圆形）；D-E 打印 3 天后细胞沿纤维高度对齐并形成肌管。
2.6 潜在的多组织应用前景
做了什么：讨论了该方法在心肌、肌腱和神经组织工程中的潜在应用。
说明什么：
- 心肌：心肌细胞（Cardiomyocytes）的同步收缩依赖于高度一致的排列，该方法可用于打印具有电生理功能的组织工程心肌。
- 肌腱/韧带：这些组织本质上是高度取向的胶原纤维束，该方法可直接模拟其天然结构。
- 神经：神经轴突的生长需要定向引导，纤维束可作为神经再生的物理轨道。
图6：A 无纤维束 vs 有纤维束组的肌管形态对比（Myosin MF20 染色），显示纤维组肌管更细长且排列整齐；B 极坐标图量化排列方向；C 对齐度统计；D 深层成像显示束位置细胞排列高度一致；E 肌管宽度量化（纤维组更细）。
三、说明什么 💡
对组织工程的意义：
- "物理填料"策略简单高效：无需复杂的光图案化或微流控设备，只需在生物墨水中加入纤维束即可实现各向异性，大大降低了技术门槛。
- 流变学与生物学双赢：纤维束既改善了 GelMA 的打印性能（减少坍塌），又提供了细胞排列线索，一举两得。
- 适用于大体积组织：在深层组织中依然保持各向异性，解决了传统方法只在表面有效的局限性。
对 3D 生物打印的意义：
- GelMA 的升级方案：纯 GelMA 缺乏力学支撑和拓扑线索，加入 PCL 纤维束后成为一种"复合生物墨水"（Composite Bioink），性能大幅提升。
- 模块化设计：纤维束可以预先制备并储存，使用时按需添加到不同生物墨水中，具有极高的灵活性。
| 发现 | 意义 |
|---|---|
| 纤维束提高 GelMA 打印精度 | 解决纯水凝胶打印易坍塌痛点 |
| C2C12 细胞沿纤维高度对齐 | 模拟骨骼肌天然各向异性结构 |
| 深层组织维持排列 | 构建大体积功能性组织成为可能 |
| 肌管形态更成熟（细长） | 促进组织功能化（收缩力/传导） |
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| CELLINK BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐ | 挤出式打印是本文的核心技术；若 CELLINK 推出"预混纤维束生物墨水"试剂盒，可直接在 BIO X6 上打印各向异性组织 |
| CELLINK GelMA | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 本文使用 GelMA 作为基质，证明 GelMA + 纤维束是最佳组合；CELLINK 可考虑推出"GelMA + PCL Microfibers"预混产品 |
| CELLINK 纤维填料（概念） | ⭐⭐⭐⭐⭐ | PCL 纤维束、胶原纤维、电纺纳米纤维等作为生物墨水添加剂是明确的蓝海市场，CELLINK 若率先推出"各向异性增强试剂盒"，将独占骨骼肌/心肌打印市场 |
| 3Brain HD-MEA | ⭐⭐⭐ | 虽然本文未涉及电生理，但排列整齐的心肌/骨骼肌组织在 3Brain MEA 上可表现出更强的同步收缩信号和电信号传导速度，是评估组织功能的金标准 |
原文下载
📄 Heilig_2025_AdvHealthcareMater_FibrillarBundles_Anisotropy.pdf
参考文献
- Heilig S, Lamberger Z, Sprenger L, et al. Fibrillar Bundles as Fibrous Filler Materials for Attaining Cell Anisotropy in Bioprinting. Adv Healthcare Mater. 2025;e2503767. DOI: 10.1002/adhm.202503767
- O'Connell CD, et al. Development of a bioink for the 3D bioprinting of anisotropic tissue constructs. Biofabrication. 2019;11:045006. DOI: 10.1088/1758-5090/ab27c0
- Skylar-Scott MA, et al. Biomanufacturing of organ-specific tissues with high cellular density and embedded vascular channels. Nat Commun. 2020;11:4634. DOI: 10.1038/s41467-020-18048-4
转发语：骨骼肌、心肌打印难点：细胞排列杂乱无章，缺乏各向异性。这篇 Adv Healthcare Mater 提出了"纤维束填料"策略：将 PCL 微纤维束混入 GelMA 生物墨水中，打印出的组织细胞自动沿纤维方向排列，形成高度定向的肌管。不仅解决了打印坍塌问题，还实现了深层组织的各向异性。CELLINK 的 GelMA+ 挤出式打印是实现这一策略的完美平台。
联系人：李东伟
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