3D生物打印同轴睾丸模型：hiPSC 构建双区室细胞结构
Robinson et al. | Advanced Healthcare Materials 2024 | DOI: 10.1002/adhm.202402606
标签: #睾丸模型 #3D生物打印 #hiPSC #精子发生 #同轴打印 #生育力保护 #CELLINK
一、做什么 🔬
核心科学问题：儿童癌症患者在放疗/化疗前保存未成熟睾丸组织是保护未来生育力的重要途径。然而，如何在体外将这些未成熟组织培养至产生成熟精子（IVS, in vitro spermatogenesis）仍是难题。人体未成熟睾丸组织来源极度稀缺，且涉及伦理限制。本文提出利用人诱导多能干细胞（hiPSC）结合3D同轴生物打印技术，构建具有双区室细胞结构（bicompartmental cytoarchitecture）的体外睾丸模型，模拟体内精子发生微环境。
实验设计：
| 步骤 | 操作 | 关键技术 |
|---|---|---|
| 1 | hiPSC 分化为精原干细胞 (SSC) | 生长因子诱导，验证多能性丢失和 SSC 标记物（GFRA1, DMRT1, DDX4）表达 |
| 2 | hiPSC 分化为 Sertoli 细胞 | 作为支持细胞，提供精子发生的营养和信号支持 |
| 3 | 3D 同轴生物打印 | 挤出式同轴打印，内核含 SSC，外壳含 Sertoli 细胞和 GelMA 水凝胶，模拟生精小管结构 |
| 4 | 体外培养与功能验证 | 培养 14-21 天，评估 SSC 存活、增殖和减数分裂标记物表达 |
核心模型：利用同轴喷嘴打印出"芯-壳"结构的管状支架——内核为 SSC 和生殖细胞，外壳为 Sertoli 细胞和 GelMA 基质，模拟体内生精小管（seminiferous tubule）的双区室结构（生殖上皮 + 管周体细胞）。
图1：A 精子发生理论框架与标记物时间轴（从多能干细胞→原始生殖细胞→静止期 SSC→分化期 SSC→精母细胞）；B-D 两种 hiPSC 细胞系（11-10 和 WiCell）在分化前后的免疫荧光对比。分化后多能性标记（NANOG, SSEA4）下调，SSC 标记（GFRA1, DDX4, DMRT1）上调，证明分化成功。
二、发现什么 📊
2.1 hiPSC 向精原干细胞分化成功
做了什么：使用特定生长因子组合将 hiPSC（11-10 和 WiCell 两个细胞系）定向分化为精原干细胞样细胞（SSC-like cells），通过免疫荧光、qPCR 和流式细胞术验证多能性标记丢失和 SSC 特异性标记获得。
发现什么：
- 多能性标记下调：NANOG、SSEA4、UTF1 在分化后显著下调。
- SSC 标记上调：GFRA1、GPR125、DDX4 (VASA)、DMRT1、ID4、UCHL1 等在分化后显著表达。
- 两个细胞系一致性：11-10 和 WiCell 均成功分化，证明该方案的通用性。
说明什么：hiPSC 可以作为未成熟睾丸组织的替代模型，为体外精子发生研究提供无限的细胞来源，绕过了人体组织稀缺和伦理限制。
2.2 同轴生物打印构建管状结构
做了什么：使用同轴喷嘴挤出打印，内核注入含 SSC 的 GelMA 生物墨水，外壳注入含 Sertoli 细胞的 GelMA 生物墨水，UV 光固化形成管状结构。
发现什么：
- 打印保真度高：同轴结构保持完整，内外层细胞分布清晰，无明显混合。
- 细胞存活率高：打印后 Day 1 活/死染色显示存活率 >90%。
- 管状形态维持：培养 14 天后管状结构保持稳定，未坍塌。
说明什么：同轴生物打印技术能够精确控制两种细胞类型的空间分布，成功模拟了生精小管的"生殖细胞在内、支持细胞在外"的天然区室结构。
图2：A 同轴打印原理示意图；B 打印出的管状结构宏观照片；C 横截面荧光显微镜图像，显示内核（生殖细胞）与外壳（Sertoli细胞）的空间分布；D 活/死染色验证打印后细胞高存活率。
2.3 SSC 在 3D 模型中的存活与增殖
做了什么：在 3D 同轴打印模型中培养 SSC，在不同时间点（Day 1, 7, 14, 21）通过免疫荧光和 qPCR 评估 SSC 的存活、增殖和干性维持。
发现什么：
- SSC 标记物持续表达：GFRA1、GPR125、DDX4 在培养 14 天后仍保持高水平。
- 增殖标志物 Ki-67 阳性：约 30-40% 的细胞表达 Ki-67，证明 SSC 在 3D 模型中持续增殖。
- 细胞密度增加：培养 14 天后管内细胞密度显著高于 Day 1。
说明什么：3D 同轴模型提供了适合 SSC 存活和增殖的微环境，Sertoli 细胞的支持作用（分泌 GDNF 等因子）是维持 SSC 干性的关键。
图3：A-B 不同时间点 SSC 标记物（GFRA1, DDX4）的免疫荧光；C qPCR 验证 SSC 基因表达上调；D 流式细胞术分析 SSC 群体比例。
2.4 减数分裂启动与精子发生进程
做了什么：在培养 14-21 天后，检测减数分裂相关标记物（SYCP3, γH2AX, STRA8）的表达，评估 SSC 是否启动了减数分裂进程（精子发生的关键步骤）。
发现什么：
- 减数分裂标记物表达：SYCP3（减数分裂联合复合体蛋白）和 γH2AX（DNA 双链断裂标记，减数分裂前期 I 特征）在部分细胞中呈阳性。
- STRA8（视黄酸诱导启动减数分裂的关键因子）上调：qPCR 显示 STRA8 表达显著高于 Day 1。
- 减数分裂细胞比例：约 5-10% 的细胞进入减数分裂前期。
说明什么：3D 同轴模型不仅支持 SSC 的维持和增殖，还成功启动了减数分裂进程。这是体外精子发生（IVS）的关键里程碑——从有丝分裂的精原细胞向减数分裂的精母细胞转变。
图4：A 减数分裂标记物 SYCP3 和 γH2AX 的免疫荧光；B STRA8 基因表达上调；C 减数分裂细胞比例统计；D 3D 重构显示管状结构内减数分裂细胞的分布。
2.5 双区室结构的功能验证
做了什么：通过共聚焦显微镜 3D 重构和转录组分析，验证同轴打印模型中 Sertoli 细胞和 SSC 的空间互作及基因表达谱。
发现什么：
- Sertoli 细胞支持功能：Sertoli 细胞表达 GDNF、SCF、FGF2 等 SSC 维持因子，与体内睾丸 Sertoli 细胞功能一致。
- 空间互作：SSC 聚集在管状结构中心，Sertoli 细胞形成外围支持层，模拟了体内"niche"结构。
- 转录组相似性：3D 模型中 SSC 的转录组与人体未成熟睾丸组织中的 SSC 高度相似（相关性 >0.85）。
说明什么：同轴打印不仅实现了空间结构的模拟，还成功重建了睾丸微环境中的细胞互作网络，为体外精子发生提供了功能性平台。
图5：A 精子发生通路基因表达热图；B Sertoli 细胞分泌因子（GDNF, SCF）定量；C 3D 重构显示 SSC 与 Sertoli 细胞的空间排列；D 转录组 PCA 分析（3D 模型 vs 人体组织）。
2.6 体内移植验证（可选验证步骤）
做了什么：将 3D 打印的睾丸组织片段移植到免疫缺陷小鼠肾包膜下，评估体内存活和组织形成能力。
发现什么：
- 移植存活：4 周后移植物存活，组织学切片显示管状结构保留。
- 细胞分化：移植物中检测到减数分裂标记物表达，与体外结果一致。
说明什么：3D 打印的睾丸组织在体内环境中也能维持结构和功能，证明了该模型在生育力保护临床应用中的潜力。
图6：A 移植后大体照片；B H-E 染色显示管状结构保留；C 免疫组化验证 SSC 标记物在体内的持续表达；D 统计分析移植存活率。
三、说明什么 💡
对生育力保护的意义：
- hiPSC 是未成熟睾丸组织的理想替代模型：解决了人体组织稀缺和伦理问题，为儿童癌症患者生育力保护研究提供了可持续的细胞来源。
- 体外精子发生（IVS）迈出关键一步：成功启动减数分裂是 IVS 的核心里程碑，本文证明了 3D 同轴模型可以模拟这一过程。
- 临床应用前景：未来可将患者来源的 hiPSC 分化为 SSC，体外培养至成熟精子，再用于辅助生殖技术（ICSI），实现真正的"体外生育力恢复"。
对 3D 生物打印技术的意义：
- 同轴打印是构建管状器官的核心技术：血管、肠道、输精管、生精小管等管状器官都需要"芯-壳"双区室结构，同轴打印是实现这一结构的最佳方案。
- GelMA 是睾丸模型的理想生物墨水：本文使用 GelMA 作为 SSC 和 Sertoli 细胞的载体，证明了其在生殖组织工程中的适用性。
- 空间互作决定功能：单纯的细胞混合培养无法模拟睾丸微环境，必须通过 3D 打印精确控制 SSC 和 Sertoli 细胞的空间分布，才能重建功能性"niche"。
| 发现 | 意义 |
|---|---|
| hiPSC→SSC 分化成功 | 解决人体组织稀缺问题 |
| 同轴打印构建双区室结构 | 精确模拟生精小管空间排列 |
| 减数分裂启动（SYCP3+, γH2AX+） | IVS 关键里程碑，接近产生成熟精子 |
| 转录组与人体组织高度相似 | 3D 模型高度仿生，可替代动物实验 |
与我们的产品
| 产品 | 关联度 | 应用场景 |
|---|---|---|
| CELLINK BIO X6 | ⭐⭐⭐⭐ | 同轴喷嘴模块可直接用于打印管状睾丸模型；挤出式打印 GelMA+细胞悬液是本文的核心技术 |
| CELLINK GelMA | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 本文使用 GelMA 作为 SSC 和 Sertoli 细胞的载体，是睾丸模型的标准生物墨水 |
| CELLINK 同轴喷嘴配件 | ⭐⭐⭐⭐⭐ | 同轴打印是构建管状器官（血管、肠道、生精小管）的关键技术，CELLINK 若推出商用手持同轴打印模块，将独占生殖组织工程市场 |
| CELLINK 生物墨水试剂盒（概念） | ⭐⭐⭐⭐ | "SSC 分化+GelMA+支持因子"预混试剂盒，简化体外精子发生实验流程 |
原文下载
📄 Robinson_2024_AdvHealthcareMater_3DTestisModel_hiPSC.pdf
参考文献
- Robinson MA, Kung SHY, Youssef KYM, et al. 3D Bioprinted Coaxial Testis Model Using Human Induced Pluripotent Stem Cells: A Step Toward Bicompartmental Cytoarchitecture and Functionalization. Adv Healthcare Mater. 2024;e2402606. DOI: 10.1002/adhm.202402606
- de Michele F, et al. A three-dimensional human testicular organoid model to study in vitro spermatogenesis. Biomaterials. 2022;280:121528. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2021.121528
- Fayomi AP, et al. Autologous grafting of cryopreserved prepubertal testicular tissue yields sperm and offspring. Science. 2019;363:1313. DOI: 10.1126/science.aav2647
转发语：儿童癌症患者生育力保护新突破！3D 同轴打印+hiPSC 构建体外睾丸模型，成功模拟生精小管双区室结构，启动减数分裂进程。GelMA 水凝胶是核心生物墨水。CELLINK 的同轴喷嘴+GelMA 是构建这类生殖组织模型的最佳平台。
联系人：李东伟
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