安捷伦 Seahorse XF Pro 细胞能量代谢分析仪 — 实验操作手册

Agilent Seahorse XF Pro — 实时检测活细胞耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），一站式评估线粒体功能与糖酵解水平
标签: #细胞代谢 #线粒体功能 #糖酵解 #Seahorse #安捷伦 #细胞能量分析 #OCR #ECAR

一、Seahorse XF 技术简介 🔬

1.1 技术原理

Seahorse XF 技术依托 Seahorse XF 能量代谢检测系统，利用专门设计的非侵入、无标记式固态荧光传感器，同时、实时测量活细胞的两条能量代谢通路，量化细胞代谢表型。

• OCR（Oxygen Consumption Rate，耗氧率）：反映线粒体呼吸功能，单位 pmol/min
• ECAR / PER（Extracellular Acidification Rate / Proton Efflux Rate，细胞外酸化率 / 质子流出速率）：反映糖酵解水平，单位 mpH/min 或 pmol/min

通过在微孔板中进行多次加药注射（最多 3-4 次），可测定细胞在不同代谢状态下的响应曲线，全面解析细胞能量代谢网络。

1.2 检测平台对比

XF Pro 分析仪可使用 Seahorse XF 细胞球体板检测 3D 细胞球的能量代谢；XFe24 分析仪可使用 Seahorse XF 胰岛捕获板检测组织类样本（如胰岛、脑组织、骨骼肌纤维、脂肪组织、斑马鱼胚胎、线虫、果蝇、拟南芥等等）的能量代谢。

二、Seahorse XF Pro 实验用试剂盒与耗材 📦

2.1 代谢检测试剂盒

2.2 耗材板（FluxPak）

2.3 培养基与试剂

三、Seahorse XF Pro 实验操作流程图 📋

3.1 整体流程概览

A. 实验前一天 — 准备工作

1. 开启并预热检测系统
2. 接种贴壁细胞
3. 水化探针板

B. 实验当天 — 上机检测

1. 水化探针板-2（取出检查）
2. 配制 Seahorse 检测液
3. 细胞换液
4. 配药并将药物加入探针板加药孔 (port)
5. 上机运行 XF 实验
6. 数据分析与归一化处理

四、实验前一天 — 准备工作 📝

4.1 开启并预热检测系统

1. 按下 Seahorse XF Pro 仪器背后的开关开启仪器主机
2. 按下 Seahorse XF Pro Controller（控制电脑）右侧边开关开启控制器
3. 打开软件 Wave Pro Control Software 1.1
4. 仪器预热至 37°C（至少 30 分钟以上）

4.2 接种贴壁细胞

XF Pro M 细胞培养微孔板接种流程：

1. 收集细胞并将其重悬至所需的最终浓度，以便接种至 80 μL 生长培养基中。单细胞悬浮液非常利于产生一致的细胞单层，在接种前最好分散聚集的细胞。在计数和接种至 XF Pro M 细胞培养微孔板之前将细胞悬液维持在室温
2. 使用多通道移液器将 80 μL 细胞悬液均匀分配到细胞培养板的每个孔中（背景校正孔除外，仅加入培养基）
3. 向每个凹槽孔（共 4 个）中添加 1.0 mL 细胞培养级水
4. 将 8 通道移液器设置为 250 μL，从凹槽中吸取 250 μL 水，沿孔壁缓慢加入，使细胞均匀分布在孔底
5. 静置 1 小时（室温）
6. 转移至 37°C 组织培养箱中培养过夜

注意事项：

• Seahorse 96 孔细胞培养板每孔的接种面积约为普通 96 孔细胞培养板的 40%（11.40 mm²）
• 上机前细胞汇合度需达到 50%–90%（建议 80%–90% 左右为最佳）
• 边缘孔（A1、A12、H1、H12）作为背景校正孔，不要加入细胞
• 细胞分布要均匀，若实验过程中细胞被损伤或被刮擦也会影响实验质量

4.3 水化探针板

1. 打开 Seahorse XFe96/XF Pro 细胞外流量分析试剂盒并取出其中的内容物
2. 将探针板倒置于工具板旁边
3. 向工具板的每个孔中加入 200 μL XF 校准液
4. 按照图示组装：水化辅助板 → 探针板 → 工具板
5. 确定 XF 校准液面高度能使探针保持浸没状态
6. 在 37°C 非 CO₂ 培养箱中水化过夜（≥ 8 小时）

注意：为避免校准液蒸发，培养箱应进行加湿处理

五、实验当天 — 上机检测 🔬

5.1 水化探针板-2（取出检查）

1. 从培养箱中取出与 XF 水化辅助板和工具板组装的探针板
2. 将探针板倒置，取出工具板和水化辅助板
3. 检查每个孔中校准液是否充足，确保探针浸没
4. 将探针板放入 Seahorse XF Pro 仪器中进行校准（约 20-30 分钟）

注：探针板加药操作详见下文 5.4

5.2 配制 Seahorse 检测液

Seahorse XF 检测液主要包含基础培养基和待添加的营养底物（glucose、glutamine、pyruvate），添加底物的种类在不同实验中有差异。

方法一：无需调 pH 的检测液（推荐，使用已调好 pH 的 Seahorse XF DMEM/RPMI 培养基）

准备物品：

• 103575-100 Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4 或 103576-100 Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4
• 103577-100 Seahorse XF 1.0 M Glucose Solution
• 103578-100 Seahorse XF 100 mM Pyruvate Solution
• 103579-100 Seahorse XF 200 mM Glutamine Solution（-20°C 保存）

配制方法：

1. 从 4°C 冰箱取出培养基，置于 37°C 水浴或温育
2. 按照试剂盒说明书添加所需底物（如 1 mM glucose、2 mM glutamine、1 mM pyruvate）
3. 将配好的检测液放入 37°C 无 CO₂ 细胞培养箱中温育备用

注意事项：

• Seahorse XF DMEM/RPMI 培养基开封后一个月内需用完
• 103579-100 Glutamine Solution 使用前充分溶化后按每 1 mL 分装冻存
• 该方法适用于所有 Seahorse 试剂盒实验

方法二：需要调 pH 的检测液（使用 Base Medium）

准备物品：

• 103335-100 Seahorse XF Base Medium
• 103577-100 Seahorse XF 1.0 M Glucose Solution
• 103578-100 Seahorse XF 100 mM Pyruvate Solution
• 103579-100 Seahorse XF 200 mM Glutamine Solution

配制方法：

1. 添加所需底物至 Base Medium 中，混匀
2. 将 100 mL 混匀的培养基置于 37°C 水浴锅内温育
3. 使用 1N NaOH 将 37°C 培养基调至 pH = 7.4 ± 0.1

   ⚠️ 调 pH 时，培养基应一直保持 37°C
   ⚠️ 加入 NaOH 时 pH 变化非常快，为避免调过，可缓慢且少量加入，或换用浓度更低的 NaOH

4. 使用 0.22 μm 滤器过滤培养基
5. 将配好的检测液放入 37°C 无 CO₂ 细胞培养箱中温育备用

5.3 细胞换液

1. 将细胞培养板从 37°C CO₂ 培养箱中取出，显微镜下观察细胞状态（汇合度 80-90% 最佳）
2. 确保背景校正孔中无细胞
3. 将细胞培养板所有孔中的生长培养基吸弃，保留 20 μL 覆盖细胞

   ⚠️ 建议勿使用真空吸液装置，因为较难控制吸液体积并容易损伤细胞
   ⚠️ 吸液时勿损伤细胞，保证足够的剩余培养基覆盖细胞

4. 向每孔加入 180 μL 预热的 Seahorse 检测液（终体积 200 μL）

   ⚠️ 换液时沿孔壁缓慢加入，避免扰动细胞

5. 将细胞培养板置于 37°C 无 CO₂ 细胞培养箱中培养 60 分钟
6. 上机检测前，显微镜下再次确认细胞状态

特殊换液说明：

• ATP Rate Assay 和 Glycolytic Rate Assay 两个实验请按特定流程换液，换液完毕终体积定为 180 μL
• 对于悬浮细胞，需使用 Cell-Tak 等组织黏附剂预处理细胞培养板

Cell-Tak 包被悬浮细胞流程：

1. 最佳 Cell-Tak 溶液浓度为 22.4 μg/mL
2. 一块细胞培养板需要 2.5 mL Cell-Tak 溶液
3. 每孔加入 40 μL Cell-Tak 溶液，室温放置 20 分钟
4. 吸弃 Cell-Tak 溶液，用无菌水清洗两次
5. Cell-Tak 包板的 Seahorse 细胞培养板在 4°C 下可以保存一周
6. 细胞接种前，Cell-Tak 包被的细胞培养板必须放至室温
7. 接种细胞后，室温放置 15-20 分钟让细胞贴壁
8. 将 130 μL 预热的检测液沿每孔侧壁缓慢补加入细胞孔，注意不要扰乱细胞

5.4 药物配制与加药

注：本部分内容以 103015-100 Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit 为例

注意事项：

• 药物重悬后在当天使用，并丢弃剩余药物，请勿冻存药物，每一包药物足够一块 XF Pro 细胞板的检测
• 使用检测液重悬和稀释药物
• 使用开盖器打开药物小瓶，确保盖子正确拧紧（盖子未拧紧会导致药物注射失败）

配药过程（线粒体压力测试）：

1. 从试剂盒中取出一包铝箔袋装药物和开盖器
2. 打开铝箔袋，取出含有 Oligomycin（蓝色盖）、FCCP（黄色盖） 和 Rotenone + Antimycin A（红色盖） 的药物小瓶
3. 按照说明书用量，用预热的 Seahorse 检测液重溶每种药物
4. 混匀后分装至加药辅助板的对应孔中

药物加载到探针板加药孔 (Port)：

• Port A：Oligomycin（最终浓度 1 μM）
• Port B：FCCP（最终浓度 0.5-1 μM，需优化）
• Port C：Rotenone + Antimycin A（最终浓度 0.5 μM）

⚠️ 使用加药辅助板辅助加药，请勿将枪头完全插入加药孔底部，否则会导致药物泄漏
⚠️ 若实验存在用户待测药物需上机检测时注射入细胞孔，则将待测药物加入 A-加药孔（Acute Injection 模板），试剂盒内药物按 B-C-D 顺序依次加入；若无待测药物或使用待测药物预处理细胞，则将试剂盒内药物按 A-B-C 顺序依次加入

FCCP 浓度优化：
每种新细胞系或检测液，必须进行药物浓度优化实验以确定最佳浓度。对 FCCP 尤其重要——FCCP 浓度偏低造成 OCR 无法达到最大响应值，而超过最适浓度会引起 OCR 下降。

5.5 上机运行

1. 将细胞培养板和探针板放入 Seahorse XF Pro 仪器
2. 在 Wave 软件中选择对应试剂盒的模板（如 Mito Stress Test）

   部分试剂盒有两个模板，标注 (Acute Injection) 的模板用于上机时注射待测药物

3. 根据实验设计完成组定义设置，将生成符合设计的分组
4. 在板布局界面完成分组布板
5. 进入程序设置界面检查程序（Mix/Wait/Measure 时间）
6. 进入运行实验界面点击 Start Run
7. 选择实验数据的保存位置，仪器弹出载板托盘
8. 放入细胞培养板和探针板，关闭托盘，开始运行

检测参数设置（典型）：

• Mix time（混匀时间）：3 分钟
• Wait time（等待时间）：2 分钟
• Measure time（检测时间）：3 分钟
• 循环次数：根据注射次数确定（通常 3-4 个循环/注射）

实验结束：

• 取出细胞培养板和探针板后，检测探针板加药孔中的药物是否全部注射入细胞孔，有无注射失败情况，并记录以备后续数据分析

5.6 数据分析与归一化

1. 在 Wave Pro 软件中导出实验数据
2. 使用 Seahorse XF Report Generator 进行数据分析和归一化
3. 根据实验需求进行细胞计数、蛋白定量或 DNA 定量等归一化处理
4. 生成代谢参数报告：基础呼吸、ATP 产量、最大呼吸、备用呼吸能力、质子漏等

六、Seahorse XF 实验常见问题及解答（附1） ❓

Q1. 可以使用失效（超出保质期）的探针板或重复使用吗？

安捷伦无法保证因使用超出保质期的探针板或重复使用探针板而得到的实验数据质量（有效性）。为得到最佳最真实的数据，请使用有效期内的探针板及其他消耗品。

Q2. 探针板水化超出水化时间怎么办？

探针板水化时间建议为 8-24 小时。如果超过 24 小时，探针可能仍然可用，但建议检查校准液是否充足，如有蒸发请补充。

Q3. 细胞培养板可单独购买吗？

可以。但探针板必须与细胞培养板配套使用（FluxPak 套装），不能单独购买探针板。

Q4. 一次实验可以只使用探针板的其中一部分吗？

为了将所有药物或化合物成功地注入细胞培养孔中，安捷伦建议水化整个探针板并将相同字母标注的全部加药孔注入药物。

Q5. 实验中为何必须设置空白/背景校正孔？

空白孔/背景校正孔被用来过滤掉实验的干扰因素，比如温度和 buffering capacity，这些干扰因素会影响氧含量和 pH 变化（非来源于代谢变化）。同时可以用于监控整板间温度波动。

Q6. 为何细胞培养板需要在 37°C 无 CO₂ 培养箱中放置 45-60 分钟？

目的是脱气，释放 CO₂。CO₂ 会溶解在培养基中形成碳酸，影响 pH 测量准确性。

Q7. Seahorse XF 报告生成器中的代谢数据是如何计算的？

在每个试剂盒的 Seahorse XF 报告生成器的用户指南中详细列出了数据的计算公式。

Q8. 进行 FAO 实验时，能够在探针板上加载 BSA-palmitate 使其自动注射入细胞孔吗？

安捷伦建议将 BSA-palmitate 或相似底物在培养细胞时做预处理。如果实验存在合理依据需在上机测量时通过注射加入 BSA-palmitate、血清或其他类似底物，请联系相关技术支持。

Q9. 使用组织黏附剂处理细胞培养板会影响 XF 实验测量吗？

不会。使用诸如 poly-L-Lysine、fibronectin、Gelatin、poly-D-lysine、collagen 等处理细胞培养板时，不会影响 XF 仪器测量的效果及实验参数分析。

Q10. Seahorse XFe96/XF Pro 细胞培养微孔板的每个细胞孔的最大体积是多少？

300 μL。

Q11. Seahorse XF 检测液中需要加入抗生素吗？

无需加入抗生素，因为大部分 XF 实验在几小时内就结束了。

Q12. 可以在 Seahorse 检测液中加入血清吗？

不建议加入血清（如 FBS），因为其会影响检测液的缓冲能力，并可能与进行检测的药物/化合物发生反应。如果必须加入血清，则加入较低浓度，或进行血清滴定实验来确定浓度。

Q13. 加入底物的检测液在多长时间内可保持稳定？可以提前配好吗？

安捷伦建议 Seahorse 检测液在实验当天现用现配。

Q14. 可以购买试剂盒中同名称的其他厂家的药物自配进行代谢检测吗？

建议使用 Seahorse 配套试剂盒进行检测，所有试剂盒均经过质量校验及验证，可保证实验数据的质量，且分析非期望数据时更容易便捷，节省时间。

Q15. Seahorse XF Pro M 细胞培养微孔板和 XFe96/XF Pro 细胞培养微孔板的区别？

Seahorse XF Pro M 细胞培养微孔板周围带有一圈水槽，可以更好地减小边缘效应，提高数据质量。且此板只适用于 Seahorse XF Pro 仪器。

Q16. 为何不能使用 GlutaMAX 来代替 Glutamine？

不建议使用 GlutaMAX 代替 Glutamine，因为 GlutaMAX 需要在细胞内代谢才能释放 Glutamine，这可能影响实验结果的准确性。

Q17. 检测液的 pH 对 XF 实验非常重要吗？

是的！ Seahorse XF 实验通过测定细胞代谢物（如氧和质子）的变化来确定 OCR 和 ECAR，而检测液 pH 会影响这些代谢的产生或消耗，因此检测液的 pH 必须精确调至 7.4 ± 0.1（在 37°C 下测量）。

Q18. Seahorse 校准液可以用来培养细胞吗？

校准液和检测液的成分基本相同，但不能用来培养细胞。

Q19. Seahorse 数据分析软件 Wave Pro 可以免费下载安装吗？

是的，可在安捷伦官网找到 Wave Pro 下载网址。

七、Seahorse XF 技术常用资源网址（附2） 🌐

1. 安捷伦 Seahorse XF 产品网址：https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis
2. 安捷伦 Seahorse Wave Pro 下载地址：https://www.agilent.com.cn/zh-cn/product/cell-analysis/seahorse-cell-analysis-software-2007523
3. 安捷伦 Seahorse XF 技术学习中心：https://www.agilent.com/zh-cn/products/cell-analysis/seahorse-assay
4. 安捷伦 Seahorse 细胞参考文献数据库（可定向可搜索）：https://www.agilent.com/search/?N=4294836537
5. 安捷伦 Seahorse Analytics 登录注册地址：https://www.agilent.com.cn/zh-cn/product/cell-analysis/seahorse-analytics-787485
6. 安捷伦 Seahorse XF 技术官网介绍：https://www.agilent.com.cn/zh-cn/solutions/cell-analysis

联系人｜李东伟
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