NanoTemper Prometheus 系列蛋白稳定性分析仪 研究报告
📋 仪器概述
NanoTemper Prometheus 系列是德国 NanoTemper Technologies 公司开发的蛋白稳定性表征仪器，采用微量差示扫描荧光技术（nanoDSF），被全球顶尖科研机构认可为蛋白稳定性表征的新黄金标准。
🎯 使用范围
适用样本类型
| 样本类型 | 具体应用 |
|---|---|
| 抗体 | 单抗、双抗、抗体药物偶联物（ADC） |
| 酶 | 各类工业酶、研究用酶 |
| 膜蛋白 | 需要去垢剂稳定的膜蛋白 |
| 疫苗 | 蛋白亚单位疫苗 |
| 其他蛋白 | 任何含有色氨酸/酪氨酸的蛋白质 |
浓度范围
- 检测范围: 0.005 mg/mL - 250 mg/mL（标准 IgG）
- 极宽动态范围: 5 μg/mL 至 250 mg/mL
样品体积
- 单样体积: 10 μL
- 上样方式: 毛细管吸入（无需手动加样）
🔬 技术原理
核心技术：nanoDSF（微量差示扫描荧光）
原理：
- 检测蛋白质内源性荧光（色氨酸和酪氨酸）
- 荧光信号与蛋白质折叠状态密切相关
- 温度升高或变性剂增加时，荧光比值变化反映蛋白去折叠过程
关键优势：
- ✅ 无标记检测：不需要染料或标记物
- ✅ 不受缓冲液限制：任何缓冲液体系都可检测
- ✅ 数据质量不受聚集影响：即使样品聚集也能获得准确 Tm 值
- ✅ 同步测量多个参数：Tm、Tonset、Tagg 一次实验获得
可选技术模块
| 技术模块 | 检测参数 | 应用 |
|---|---|---|
| nanoDSF | Tm, Tonset, Ea, 复性 | 热稳定性/化学稳定性 |
| DLS（动态光散射） | Tscattering, Tsize, rH, PDI, kD | 粒径、分散性、聚集温度 |
| SLS（静态光散射） | 平均散射强度、分子量、第二维里系数 B22 | 分子量、相互作用 |
| Backreflection（背反射） | Tturbidity | 聚集检测（粒径>12.5 nm） |
📊 仪器型号与配置
Prometheus 系列型号对比
| 型号 | NT.48 | NT.Plex | NT.Plex + NT.RA |
|---|---|---|---|
| 通量 | 1-48 个样品 | 1-1536 个样品 | 1-1536 个样品（全自动） |
| 上样方式 | 单根毛细管/毛细管组 | 毛细管芯片 | 机械手臂自动上样 |
| 运行时间 | 18-75 分钟 | 4 小时至过夜（384 样品） | 全自动无人值守 |
| 体积 | 35×51×52 cm | 110×188×90 cm | 110×188×90 cm |
| 重量 | 30 kg | 200 kg | 200 kg |
| 适用场景 | 实验室研发 | 高通量筛选 | 工业化筛选 |
Prometheus Panta（旗舰型号）
集成四项技术：
- nanoDSF（标配）
- DLS（标配）
- SLS（选配）
- Backreflection（选配）
温控性能：
- 温控范围：15°C - 110°C（环境温度 25°C 时）
- 升温速率：0.1°C/min - 7°C/min 可调
- 温控精度：±0.1°C
荧光检测：
- 激发波长：280 nm
- 发射波长：330 nm 和 350 nm
- 初始荧光比值重复性：0.009
🧪 主要应用
1️⃣ 缓冲液筛选与制剂优化
应用场景：
- 筛选最佳 pH 条件
- 盐浓度优化
- 添加剂/稳定剂筛选
- 处方开发
实验设计：
- 一次运行可测试 48 个不同条件
- 同步获得 Tm、Tagg、Tonset 多个参数
- 快速确定最佳储存条件
案例：勃林格殷格翰使用 PR NT.48 筛选单抗最佳 pH 制剂，用于长期储存研究。
2️⃣ 候选分子筛选与表征
应用场景：
- 抗体候选分子稳定性排序
- 突变体稳定性比较
- 生物类似药与原研药对比
- 蛋白品质鉴定
优势：
- 微量样品（10 μL）即可检测
- 高通量快速筛选
- 数据重复性好，支持统计比较
3️⃣ 配体结合/相互作用研究
应用场景：
- 蛋白 - 小分子结合
- 蛋白 - 蛋白相互作用
- 配体结合亲和力测定
- 结合热力学参数（Ea 活化能）
原理：
- 配体结合会改变蛋白热稳定性
- Tm 位移反映结合强度
- 可计算结合常数
4️⃣ 膜蛋白去垢剂筛选
应用场景：
- 去垢剂类型筛选
- 去垢剂浓度优化
- 膜蛋白稳定性评价
优势：
- 不受去垢剂干扰（内源荧光检测）
- 可检测膜蛋白在去垢剂胶束中的稳定性
5️⃣ 酶库高通量筛选
应用场景：
- 工业酶稳定性评价
- 酶突变体库筛选
- 最佳反应条件确定
通量：
- NT.Plex + NT.RA：单次运行 1536 个样品
- 全自动无人值守
6️⃣ 单抗酶切消化优化
应用场景：
- 抗体酶切条件优化
- 酶切时间/温度/比例优化
- 酶切产物稳定性评价
案例：快速优化单抗 Fab 片段制备条件。
7️⃣ 聚集研究与控制
应用场景：
- 聚集起始温度（Tagg）测定
- 聚集动力学研究
- 抗聚集配方筛选
技术：
- Backreflection 模块检测聚集
- DLS 监测粒径变化
- 同步获得 Tm 和 Tagg
📈 检测参数说明
| 参数 | 含义 | 应用 |
|---|---|---|
| Tm | 50% 蛋白去折叠时的温度 | 热稳定性评价 |
| Tonset | 去折叠起始温度 | 早期稳定性变化检测 |
| Tagg | 聚集起始温度 | 聚集倾向评价 |
| Tscattering | 光散射起始温度 | 聚集检测 |
| rH | 流体动力学半径 | 粒径大小 |
| PDI | 多分散指数 | 样品均一性 |
| Cm | 50% 去折叠时的变性剂浓度 | 化学稳定性 |
| ΔG | 去折叠自由能 | 折叠稳定性 |
| Ea | 活化能 | 折叠/去折叠动力学 |
| B22 | 第二维里系数 | 分子间相互作用 |
💻 软件系统
控制软件
| 软件 | 用途 |
|---|---|
| PR.ThermControl | 热变性实验控制与基础分析 |
| PR.ChemControl | 化学变性实验控制（ΔG、Cm 测定） |
| PR.TimeControl | 时间控制实验（等温、循环变温） |
分析软件
PR.Stability Analysis：
- 数据分类、筛选、可视化
- 多样品数据比对
- 统计分析
- 直接导出用于发表
合规性
- ✅ 21 CFR Part 11 规范支持
- 适用于制药行业监管要求
⚙️ 仪器特点
优势
-
无标记检测
- 不需要染料
- 不影响蛋白天然状态
- 适用于任何缓冲液体系
-
微量样品
- 仅需 10 μL
- 适合珍贵样品
- 毛细管自动吸入
-
高通量灵活性
- 1 个到 1536 个样品自由选择
- 可单样检测也可批量筛选
- 可选全自动上样
-
数据质量高
- 高密度数据点
- 可检测细微稳定性差异
- 重复性好
-
操作简便
- 几乎不需要使用经验
- 软件引导式操作
- 仪器小巧无需维护
-
多参数同步
- 一次实验获得 Tm、Tonset、Tagg 等
- 节省时间和样品
- 数据更全面
局限
-
需要色氨酸/酪氨酸
- 不含 Trp/Tyr 的蛋白无法检测
- 可通过突变引入 Trp 解决
-
高温模块限制
- 标准版最高 95°C
- 高温版可达 110°C（选配）
-
DLS 检测限
- 小分子量蛋白（<12 kDa）DLS 信号弱
- 建议用 nanoDSF 为主
🔬 实验类型
1. 热变性实验（Thermal Shift）
条件：
- 温度范围：15-95°C（或 110°C）
- 升温速率：0.1-7°C/min
- 典型条件：1°C/min
输出：
- 荧光比值 vs 温度曲线
- Tm、Tonset、Tagg
时间：18-75 分钟（48 样品）
2. 化学变性实验（Chemical Denaturation）
条件：
- 变性剂：尿素或盐酸胍
- 浓度梯度：0-8 M
- 等温检测
输出：
- 荧光比值 vs 变性剂浓度
- Cm（50% 去折叠浓度）
- ΔG（去折叠自由能）
时间：~40 秒/样品
3. 等温实验（Isothermal）
应用：
- 长时间稳定性监测
- 折叠/去折叠动力学
- 结合动力学
条件：
- 固定温度
- 时间：几分钟到几小时
4. 循环变温实验（Temperature Ramp Cycling）
应用：
- 可逆性研究
- 复性评价
- 热历史影响
条件：
- 多次升降温循环
- 自定义温度程序
📚 典型应用案例
案例 1：单抗制剂筛选
目的：筛选最佳 pH 和缓冲液条件
实验设计：
- 48 个条件：pH 5.0-8.0 × 6 种缓冲液
- 样品浓度：1 mg/mL
- 运行时间：45 分钟
结果：
- 确定 pH 6.0 为最佳条件（Tm 最高，Tagg 最高）
- 用于后续长期稳定性研究
案例 2：生物类似药对比
目的：对比生物类似药与原研药稳定性
实验设计：
- 原研药 vs 3 个候选类似药
- 热变性 + 化学变性
- 每个条件 3 次重复
结果：
- Tm 差异 < 0.5°C
- ΔG 差异不显著
- 支持相似性评价
案例 3：膜蛋白去垢剂筛选
目的：筛选最佳去垢剂稳定膜蛋白
实验设计：
- 8 种去垢剂（DDM、OG、LDAO 等）
- 浓度梯度：0.01%-2%
- nanoDSF + DLS 同步检测
结果：
- DDM 0.05% 条件最佳（Tm 最高，粒径均一）
- 用于后续结晶研究
📊 与其他技术对比
| 技术 | 样品量 | 通量 | 标记 | 缓冲液限制 | 聚集影响 |
|---|---|---|---|---|---|
| nanoDSF | 10 μL | 高 | 无 | 无 | 无影响 |
| DSC | 300-500 μL | 低 | 无 | 低盐 | 影响大 |
| DSF（染料法） | 20 μL | 高 | 需要 | 有 | 有影响 |
| CD | 200-400 μL | 低 | 无 | 低盐 | 影响大 |
🎯 选购建议
实验室研发（小规模）
- 推荐: Prometheus NT.48
- 通量: 1-48 样品
- 预算: 基础配置
- 升级: 可加 Backreflection 模块
高通量筛选（中等规模）
- 推荐: Prometheus NT.Plex
- 通量: 1-1536 样品
- 预算: 中等
- 配置: 包含 DLS 模块
工业化筛选（大规模）
- 推荐: Prometheus Panta + Robotic Autosampler
- 通量: 全自动 1536 样品
- 预算: 高
- 配置: 全部模块 + 机械手臂
📖 总结
NanoTemper Prometheus 系列是蛋白稳定性表征的黄金标准仪器，适用于：
✅ 抗体/蛋白药物研发
✅ 制剂开发与优化
✅ 候选分子筛选
✅ 质量控制
✅ 基础科学研究
核心优势：无标记、微量、高通量、多参数同步、数据质量高。
参考文献:
- Nature Reviews Methods Primers 2022 (类器官技术综述)
- NanoTemper Technologies 官方技术资料
- Prometheus 系列应用手册 2025